5. Визначення чутливості мікобактерій туберкульозу до антимікобактеріальних препаратів

5.1 Критерії стійкості M.tuberculosis до антимікобактеріальних препаратів

Визначення спектра і ступеня стійкості мікобактерій туберкульозу до антимікобактеріальних препаратів має суттєве значення для тактики хіміотерапії хворих, для контролю за ефективністю лікування і визначення прогнозу захворювання. Зміна чутливості мікобактерій відзначається до усіх антимікобактеріальних препаратів, проте відрізняється за ступенем, частотою і швидкістю появи стійких варіантів. Чутливими до антимікобактеріальних препаратів вважаються ті мікобактерії туберкульозу, на які препарат у концентрації, що досягається у вогнищі інфекції, спричиняє бактеріостатичну або бактеріцидну дію, незалежно від поза- або внутрішньоклітинного їх розташування.

Відповідно до цього, критерії чутливості мікобактерій туберкульозу залежать від концентрації медикаментозного препарату у вогнищі ураження, величини максимальної терапевтичної дози препарату, його фармакокінетики. Чутливість мікобактерій туберкульозу до антимікобактеріальних препаратів корелюється з мінімальною концентрацією препарату, що затримує (інгібує) ріст мікобактерій при стандартних умовах постановки досліду. Розподіл мікобактерій туберкульозу на чутливі і стійкі відбувається на підставі критеріїв, що встановлені клініко-лабораторними дослідженнями (табл.5.1).

Визначення медикаментозної чутливості виділених культур M.tuberculosis у вперше виявлених хворих необхідно обов'язково проводити до стрептоміцину, ізоніазиду, етамбутолу, рифампіцину. В випадку наявності стійкості до цих препаратів рекомендується проведення тесту медикаметозної чутливості до етіонаміду (або протіонаміду), канаміцину та фторхінолонам. У хворих з хронічним перебігом туберкульозу необхідно проводити визначення медикаментозної чутливості M.tuberculosis до всіх препаратів з урахуванням результатів попередніх досліджень.

Таблиця 5.1 - Критерії оцінки медикаментозної стійкості M.tuberculosis на яєчних середовищах (в мкг/мл)

Визначення медикаментозної чутливості мікобактерій туберкульозу може проводитися бактеріологічними методами в щільному або в рідкому живильному середовищі. Існують модифікації обох методів.

Модифікації методу визначення медикаментозної чутливості в рідкому середовищі представлені методом глибинного посіву мікобактерій (за Школьниковою) і методом мікрокультивування на скельцях (за Прайсом). Методи визначення чутливості мікобактерій у рідких середовищах більш трудомісткі, вимагають додаткового приготування мазків, їх фарбування і мікроскопіювання. Проте, результати визначення одержують у більш короткі терміни (від 8 до 12 діб). Метод мікрокультивування на скельцях і метод глибинного посіву застосовуються, як правило, для прямого визначення чутливості мікобактерій безпосередньо з патологічного матеріалу. При цьому в патологічному матеріалі повинно міститися не менше 1-5 мікобактерій у полі зору.

Для непрямого визначення чутливості з вирощеної культури потрібно приготувати завись в ізотонічному розчині хлористого натрію, відцентрифугувати протягом 2-3 хвилин і з надосадної рідини стерильною пастерівською піпеткою нанести 2 краплі на відстані 1,0 см одна від одної на 1/3 вузького скельця. Далі роблять так само, як і при прямому визначенні чутливості.

Модифікації методу визначення медикаментозної чутливості на щільному середовищі представлені методом абсолютних концентрацій і методом пропорцій. Ці методи менш трудомісткі, але визначення проводиться з вже виділених культур (непрямий метод). Ця обставина подовжує терміни одержання результатів. При методі пропорцій визначення чутливості відбувається шляхом засіву дозованої кількості мікобактерій, що дозволяє більш точно визначити ступінь їх чутливості.

Вибір методу залежить від можливостей лабораторії, що виконує дослідження. Для визначення чутливості M.tuberculosis до антимікобактеріальних препаратів використовується середовище Льовенштайна-Єнсена, яке прийнято за міжнародний стандарт ВООЗом.

5.1.1 Визначення чутливості мікобактерій туберкульозу до антимікобактеріальних препаратів методом абсолютних концентрацій на щільних середовищах

Принцип методу полягає у вирощуванні мікобактерій, виділених від хворого, на щільних живильних середовищах, що містять "критичні" концентрації препаратів (критерії резистентності).

Приготування зависі (суспензії) культури.

Готують гомогенну бактеріальну суспензію в 0,9 % розчині NaCl. Для цього культуру, що виросла на твердому живильному середовищі Льовенштайна-Єнсена знімають тампоном, попередньо змоченим у стерильному 0,9 % розчині NaCl, при цьому тампон повинен стикатися з усією поверхнею середовища. Потім тампон занурюють в пробірку, що містить 2,0 мл стерильного 0,9 % розчину NaCl, змивають культуру в рідину, попередньо розтираючи по внутрішнім стінкам пробірки. Пробірку залишають на 30 хвилин при кімнатній температурі для осадження крупних часточок культури.

Суспензію культури стандартизують по бактеріальному стандарту каламутності 5 ОД. Для цього суспензію (без осаду) обережно, не торкаючись дна пробірки, відсмоктують піпеткою в іншу пробірку та розводять її ще в 10 разів в ізотонічному розчині NaCl.

Приготування щільного живильного середовища. У флакони з яєчним середовищем Льовенштайна-Єнсена до згортання додають розведення антимікобактеріальних препаратів. Розведення препаратів готують, створюючи в середовищі їх "критичні" концентрації, із таблеток або ампул для парентерального введення препарату, ці розведення можна зберігати в холодильнику протягом 2 - 3 тижнів.

Важливо відмітити, що для отримання точних та якісних результатів тесту медикаментозної чутливості в Україні буде здійснюватися поступовий перехід від таблетованих та рідких лікарських форм на більш якісні хімічно чисті субстанції лікарських препаратів провідних світових виробників (Sigma, Fatol-Arzneimittel та інш.).

5.1.1.1 Розведення антимікобактеріальних препаратів

Розрахунки робляться на 50,0 і 100,0 мл середовища, яке після внесення розведення відповідного препарату розливається приблизно по 5,0 мл. Таким чином отримують середовище з препаратом для визначення чутливості відповідно до 10 - 20 культур мікобактерій. Для розведень всіх препаратів користуються стерильною дистильованою водою.

Стрептоміцин

Для визначення медикаментозної чутливості до стрептоміцину використовують дигідрострептоміцинсульфат.

1-е розведення - 100,0 мг/мл: флакон, що містить 500,0 мг (0,5 г) стрептоміцину + 5,0 мл води; якщо флакон містить 1000,0 мкг/мл стрептоміцину (1,0 г), відповідно додають 10,0 мл води.

2-е розведення - 10,0 мг/мл (10 000 мкг/мл): 1,0 мл 1-го розведення + 9,0 мл води.

3-є розведення - 2500,0 мкг/мл: 3,0 мл 2-го розведення + 9,0 мл води.

4-е розведення - 250,0 мкг/мл: 1,0 мл 3-го розведення + 9,0 мл води.

Після додавання 1,0 мл 4-го розведення до 49,0 мл середовища отримаємо в ньому 5,0 мкг/мл стрептоміцину. До 98,0 мл середовища відповідно додають 2,0 мл розведення.

Ізоніазид

Беруть ампулу 5,0 мл 10,0 % розчину препарату. Вона містить в 1,0 мл 100,0 мг ізоніазиду.

1-е розведення - 10,0 мг/мл: 1,0 мл із ампули + 9,0 мл води.

2-е розведення - 1,0 мг/мл (1000 мкг/мл): 1,0 мл 1-го розведення + 9,0 мл води.

3-є розведення - 250,0 мкг/мл: 3,0 мл 2-го розведення + 9,0 мл води.

4-е розведення - 50,0 мкг/мл: 2,0 мл 3-го розведення + 8,0 мл води.

Після додавання 1,0 мл 4-го розведення до 49,0 мл середовища отримаємо 1,0 мкг/мл препарату. До 98,0 мл середовища відповідно додають 2,0 мл розведення.

Етіонамід (або протіонамід)

1-е розведення - 25,0 мг/мл: таблетку, що містить 250,0 мг етіонаміду (або протіонаміду), обережно розтирають в порцеляновій ступці до однорідного порошку +1,0 мл етилового спирту (для дезинфекції) + 9,0 мл води.

2-е розведення - 5,0 мг/мл: 2,0 мл із ступки + 8,0 мл води.

3-є розведення - 1,0 мг/мл (1000,0 мкг/мл): 2,0 мл 2-го розведення + 8,0 мл води.

Якщо внести 1,5 мл 3-го розведення в 48,5 мл середовища, отримаємо концентрацію препарату 30,0 мкг/мл. До 97,0 мл середовища відповідно додають 3,0 мл розведення.

Канаміцин

Беруть ампулу канаміцину, що містить 500,0 мг в 2,0 мл розчину, тобто 250,0 мг/мл.

1-е розведення - 25,0 мг/мл: 1,0 мл із ампули + 9,0 мл води.

2-е розведення - 5,0 мг/мл: 2,0 мл 1-го розведення + 8,0 мл води.

3-є розведення - 1,0 мг/мл (1000,0 мкг/мл): 2,0 мл 2-го розведення + 8,0 мл води.

Якщо внести 1,5 мл 3-го розведення в 48,5 мл середовища, отримаємо концентрацію препарату 30,0 мкг/мл. До 97,0 мл середовища відповідно додають 3,0 мл розведення.

Рифампіцин (рифадин, мікобутин)

1-е розведення - 15 мг/мл: 150,0 мг розчинного порошку рифампіцину, що міститься в ампулі для парентерального введення, розчиняють в 10,0 мл води.

Якщо ампульного рифампіцину немає, беруть капсулу, що містить 150,0 мг препарату, висипають в стерильну пробірку + 1,0 мл етилового спирту (для дезинфекції) + 9,0 мл води. Ретельно розмішують піпеткою, отриману завись щоразу перед кожним розведенням ретельно перемішують.

2-е розведення - 1,5 мг/мл (1500 мкг/мл): 1,0 мл 1-го розведення + 9,0 мл води.

3-є розведення - 1000,0 мкг/мл: 2,0 мл 2-го розведення + 1,0 мл води (краще брати вдвічі більший об'єм - 4,0 мл + 2,0 мл води).

Внести 1,0 мл 3-го розведення в 49,0 мл середовища, отримаємо 20,0 мкг/мл (або 2,0 мл в 98,0 мл середовища).

Етамбутол

1-е розведення - 20,0 мг/мл: таблетку, що містить 400,0 мг препарату, ретельно розтирають в ступці + 1,0 мл етилового спирту + 19,0 мл води.

2-е розведення - 2,0 мг/мл (2000,0 мкг/мл): 1,0 мл із ступки + 9,0 мл води.

3-є розведення - 250 мкг/мл: 1,0 мл 2-го розведення + 7,0 мл дистильованої води.

Внести 1,0 мл 3-го розведення в 49,0 мл середовища, отримаємо 10,0 мкг/мл (або 2,0 мл в 98,0 мл середовища).

Хід дослідження.

Живильне середовище з різними концентраціями антимікобактеріальних препаратів розливають у пробірки приблизно по 5,0 мл і згортають у скошеному вигляді при 85 градусів Цельсію протягом 30 хвилин в апараті для згортування сироватки крові. Середовище з антимікобактеріальними препаратами можна зберігати в холодильнику при температурі 2 - 4 градуса Цельсію не більше 1-го місяця. Але краще готувати свіже середовище щотижня. Пробірки з приготованими середовищами, що містять медикаментозні препарати, і одну контрольну пробірку із середовищем, що не містить препаратів, засівають приготованою зависсю культури, по 0,2 мл у кожну пробірку (див. вище).

Пробірки поміщають у нахиленому стані в термостат при 37 градусів Цельсію, на другий день закривають гумовими корками замість ватно-марлевих або парафінують, щоб запобігти висиханню середовища і ставлять вертикально. Посіви переглядають щотижня. Через 2 - 3 тижні після посіву реєструють отримані результати. При бідному рості в контролі пробірки ставлять ще на тиждень у термостат, після чого дають остаточну відповідь.

Оцінка результатів.

Культура вважається чутливою, якщо в пробірці із середовищем, що містить препарат, виросло менше 20 колоній при рясному рості в контролі. Тільки при наявності більше 20 колоній культура розцінюється як стійка до тієї концентрації препарату, що міститься в середовищі.

При будь-якому методі визначення чутливості мікобактерій до антимікобактеріальних препаратів необхідно кожну серію приготованого живильного середовища з препаратами перевірити, засіваючи завідомо чутливою культурою мікобактерій туберкульозу. Для контролю можна користуватися чутливим лабораторним штамом M.tuberculosis H37Rv або будь-якою старанно перевіреною чутливою культурою M.tuberculosis. Контрольна культура засівається так само, як і та, що випробовується.

Якщо середовища з препаратами приготовані правильно, контрольна культура не повинна рости при критичних концентраціях препарату, при яких не ростуть чутливі до медикаментозних препаратів штами. Поява росту контрольного штаму в пробірці з препаратом вказує на допущення помилок при приготуванні середовища з цим препаратом або на неправильне приготування бактеріальної суспензії.

5.1.2 Визначення стійкості МБТ до антимікобактеріальних препаратів методом пропорцій (метод Канетті)

Данний метод широко застосовується в усьому світі, є коректним, інформативним і точним.

Принцип методу полягає у виявленні пропорції між чутливими та стійкими особинами в популяції штаму МБТ, виділеному від хворого. Якщо кількість стійких особин до якогось антибактеріального препарату в популяції буде менше 1,0 %, такий штам вважається чутливим до даного препарату. Якщо стійкість особин в популяції більше 1,0 % - штам вважається стійким до даного препарату.

I Приготування розведень антимікобактеріальних препаратів

Для приготування розведень використовуються хімічно чисті (х/ч) субстанції препаратів. Субстанції розводять стерильною дистильованою водою, наважка яких перераховується згідно вказанному на етикетці коефіцієнту потенції для кожної хімічно чистої речовини.

Ізоназид (INH) (субстанця фрми FATOL-ARZNEIMITTEL)

Розчин - I : концентрація 5000 мкг/ мл - 50,0 мг INH - порошку розчинити в 10,0 мл води.

Розчин - II: концентрація 100,0 мкг/ мл - 2,0 мл розчину I + 98,0 мл води.

Розчин - III: концентрація 10,0 мкг/ мл - 5,0 мл розчину II + 45,0 мл води.

За рекомендаціями ВООЗ досліджуються концентрації 0,1 мкг/мл, 0,2 мкг/мл і 1,0 мкг/мл. "Критична" концентрація в середовищі - 0,2 мкг/мл вдповда невисокому ступеню стійкості.

Рифампцин (RMP) (субстанця фрми FATOL-ARZNEIMITTEL)

Рифампцин-натрій, коефіцінєт поправки = 1,04 х/ч речовини

Розчин - I: концентрація 4000 мкг/ мл - 62,4 мг RMP - порошку розчинити в 15,0 мл води.

Розчин - II: концентрація 400,0 мкг/ мл - 10,0 мл розчину I + 90,0 мл води.

Розчин - III: концентрація 200,0 мкг/ мл - 5,0 мл розчину II + 5,0 мл води.

За рекомендаціями ВООЗ досліджуються концентрації: 20,0 мкг/мл і 40,0 мкг/мл. "Критична" концентрація в середовищі 40,0 мкг/мл відповідає невисокому ступеню стійкості.

Стрептоміцин (SM) (субстанція фірми SIGMA)

Дигідрострептоміцинсульфат, коефіцієнт поправки = 1.25 х/ч речовини

Розчин - I: концентрація 5000 мкг/мл - 50,0 мг порошку розчинити в 8,0 мл води.

Розчин - II: концентрація 100,0 мкг/мл - 2,0 мл розчину I + 98,0 мл води.

Розчин - III: концентрація 20,0 мкг/мл - 2,0 мл розчину II + 18,0 мл води.

За рекомендаціями ВООЗ досліджуються концентрації: 4,0 мкг/мл і 8,0 мкг/мл. "Критична" концентрація в середовищі - 4,0 мкг/мл відповідає невисокому ступеню стійкості.

Етамбутол (EMB) (субстанця фрми FATOL-ARZNEIMITTEL)

Етамбутол-2HCl, коефіцієнт поправки = 1,36 х/ч речовини

Розчин - I: концентрація 1000 мкг/мл - 136,0 мг EMB - порошку розчинити в 100,0 мл води.

Розчин - II: концентрація 20,0 мкг/мл - 2,0 мл розчину I + 98,0 мл води.

Розчин - III: концентрація 5,0 мкг/мл - 10,0 мл розчину II + 30,0 мл води.

За рекомендаціями ВООЗ досліджуються концентрації: 1,0 мкг/мл; 2,0 мкг/мл. "Критична" концентрація в середовищі 2,0 мкг/мл відповідає невисокому ступеню стійкості.

Протіонамід (PTH) (аналог етонаміду) (субстанція фірми FATOL-ARZNEIMITTEL)

Розчин - I: концентрація 4000 мкг/мл - 40,0 мг PTH - порошку розчинити в 5,0 мл DMSO (диметилсульфоксид).

Розчин - II: концентрація 400,0 мкг/мл - 10,0 мл розчину I + 90,0 мл води.

Розчин - III: концентрація 200,0 мкг/мл - 10,0 мл розчину II + 10,0 мл води.

За рекомендаціями ВООЗ досліджуються концентрації 20,0 мкг/мл і 40,0 мкг/мл. "Критична" концентрація в середовищі - 20,0 мкг/мл відповідає невисокому ступеню стійкості.

Амід нікотиново кислоти (NSA) (аналог празинамду) (субстанця фрми FATOL-ARZNEIMITTEL)

Розчин I: концентрація 40 000 мкг/мл - 2000 мг NSA - порошку розчинити в 50,0 мл води.

Розчин - II: концентрація 20 000 мкг/мл - 25,0 мл розчину I + 25,0 мл води.

Розчин - III: концентрація 10 000 мкг/мл - 25,0 мл розчину II + 25,0 мл води.

За рекомендаціями ВООЗ досліджуються концентрації: 1,0 г/л; 2,0 г/л і 4,0 г/л. "Критична" концентрація в середовищі 1,0 г/л відповідає невисокому ступеню стійкості.

II Приготування суспензії культури МБТ

Готують гомогенну бактеріальну суспензію в 0,9 % розчині NaCl. Для цього культуру, що виросла на твердому живильному середовищі Льовенштайна-Єнсена знімається тампоном, попередньо змоченим у стерильному 0,9 % розчині NaCl, при цьому тампон повинен стикатися з усією поверхнею середовища. Потім тампон занурюють в пробірку, що містить 2,0 мл стерильного 0,9 % розчину NaCl, культуру змивають в рідину, попередньо розтираючи по внутрішнім стінкам пробірки. Пробірку залишають на 30 хвилин при кімнатній температурі для осадження крупних часточок культури.

Суспензію культури стандартизують по бактеріальному стандарту каламутності 1 McF. Для цього суспензію (без осаду) обережно, не торкаючись дна пробірки, вдсмоктують ппеткою в іншу пробірку з 0,9 % розчином NaCl.

З цієї суспензії готуються наступні розведення:

- 1:10 (0,9 мл 0,9 % розчину NaCl + 0,1 мл суспензії);

- 1:100 - контроль 1 (К1) (1,8 мл 0,9 % розчину NaCl + 0,2 мл розведення 1);

- 1:1000 - контроль 2 (К2) (1,8 мл 0,9 % розчину NaCl + 0,2 мл К1);

- 1:10000 - контроль 3 (К3) (1,8 мл 0,9 % розчину NaCl + 0,2 мл К2).

Пробірки маркують.

З кожної пробірки (К1, К2, К3) робиться висів бактеріальної суспензії в кількості 100,0 мкл (0,1 мл) на середовище Льовенштайна-Єнсена. Це контрольні пробірки.

З розведения 1:100 = К1 по 100,0 мкл (0,1 мл) суспензії культури засваться на пробірки з середовищем Льовенштайна-Єнсена, що містять вказан вище концентрації препаратів. Пробірки маркрують і поміщають в горизонтальному положенн в термостат при 37 град. Цельсію, наступного дня перекривають стерильними гумовими корками для запобігання висихання середовища і ставлять вертикально.

Посіви проглядають щотижня. Через 2-4 тижн. після посіву, максимум через 6 тижнів, реєструють отримані результати.

Оцінка результатів.

При обліку результатів за методом Канетт кількість колоній, що виросли в контрольній пробірці К1 (вихідне розведення мікробної суспензії 1:100) приймається за 100 %; кількість колоній, що виросли в К2 відповідає 10 % усі бактеріальній популяції; кількість колоній, що виросли в К3 відповідає 1 % бактеріально популяції.

Якщо в контрольних пробірках К1, К2, К3 при посіві досліджуваного штаму МБТ спостерігається ріст відповідно до вищезгаданих пропорцій, можна робити облік результатів стійкості в пробірках з препаратами. При цьому в К3 повинно бути більше 30 не більше 100 колоній. Інтенсивність росту в контролях в пробірках з препаратами оцінються в такий спосіб:

- - до 10 колоній;

1 + - 10-20 колоній;

2 + - 20-100 колоній, між колоніями можна бачити острівці середовища;

3 + - більше 100 колоній.

Культура МБТ є "чутливою", якщо в пробірці з "критичною" концентрацією препарату нема росту, або спостерігаться до 10 колоній, тобто менше 1 % бактеріальної популяції.

Культура МБТ є "стійкою", якщо в пробірці з "критичною" концетрацією препарату спостерігаться більше 10 колоній, тобто більше 1,0 % бактеріальної популяції.

Дослідження потрібно повторити, якщо:

- нема пропорційності росту між К1, К2, К3; - К3 - негативний або виросло менше 30 колоній;

- К1, К2, К3 або один з них забруднено;

- забруднені пробірки з препаратами.

Результати визначення резистентності вносяться в таблицю:

Дослідження мікобактерій на чутливість до антимікобактеріальних препаратів

Примітка:

ы - позначені критичні концентрації препаратів в середовищі Льовенштайна - Єнсена.

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10