Для диференціювання M.tuberculosis і M.bovis від інших мікобактерій можна використовувати здатність атипових і сапрофітних мікобактерій до росту на середовищі Льовенштайна-Єнсена з 500,0 мкг/мл саліциловокислого натрію або паранітробензойної кислоти, доданої до середовища в тій же концентрації, а також ріст на середовищі з 10,0 мкг/мл тіоацетазону (тібону). Ці речовини інгібують ріст М.tuberculosis та M.bovis, на відміну від інших мікобактерій, що ростуть добре в їх присутності. Контролем служить середовище без препаратів.

3.2.1.1 Приготування середовища із саліциловокислим натрієм

Інгредієнти.

1. Натрій саліциловокислий.

2. Етиловий спирт 96 %.

3. Середовище Льовенштайна-Єнсена - 100,0 мл (до згортання).

Середовище з саліциловокислим натрієм готують так: наважку 50,0 мг препарату висипають в пробірку, заливають 1,0 мл етилового спирту для дезинфекції, додають 2,0 мл стерильної дистильованої води і виливають в 97,0 мл середовища Льовенштайна-Єнсена (до згортання). Ретельно розмішують. Тепер середовище містить 0,5 мг препарату в 1,0 мл, тобто 500,0 мкг/мл. Розливають у пробірки приблизно по 5,0 мл. Згортають в скошеному вигляді при 85 град. Цельсію протягом 30 хвилин в апараті для згортання сироватки крові.

3.2.1.2 Приготування середововища з паранітробензойною кислотою

Інгредієнти.

1. Паранітробензойна кислота.

2. Етиловий спирт 96 %.

3. Їдкий натр.

4. Соляна кислота.

5. Середовище Льовенштайна-Єнсена - 100,0 мл (до згортання).

50,0 мг паранітробензойної кислоти добре розтирають у ступці товкачиком, додають 1,0 мл етилового спирту, 4,0 мл дистильованої води і 20-24 краплі 4,0 % NaOH до рН - 8,0 (по індикаторному папірцю). Після цього додають 1-2 краплі 10,0 % HCl до рН - 7,0. Усе це додають до 95,0 мл яєчного середовища, попередньо профільтрованого. Одержують концентрацію паранітробензойної кислоти 500,0 мкг/мл. Розливають у пробірки приблизно по 5,0 мл. Згортають в скошеному вигляді при 85 град. Цельсію протягом 20-30 хвилин в апараті для згортання сироватки крові.

3.2.1.3 Приготування середовища з тіоацетазоном (тібоном)

Принцип.

Тіоацетазон (тіосемікарбазон пара-ацетамінобензальдегід), протитуберкульозний препарат. М.tuberculosis та M.bovis чутливі до цього препарату, тоді як інші мікобактерії, за винятком M. kansasii, до нього стійкі.

Інгредієнти.

1. Тіоацетазон (тібон).

2. Етиловий спирт 96 %.

3. Середовище Льовенштайна-Єнсена - 100,0 мл (до згортання).

Готують розчин тіоацетазону, що містить 1000,0 мкг/мл препарату. Для цього до наважки 10,0 мг тібону, висипаної в пробірку, додають 1,0 мл етилового спирту і 9,0 мл стерильної дистильованої води, отримують розведення 1,0 мг/мл (1000,0 мкг/мл). 1,0 мл цього розведення додають до 99,0 мл яєчної маси - одержують концентрацію тібону 10,0 мкг/мл і розливають у пробірки по 5,0 мл. Середовище в пробірках згортають в скошеному вигляді в апараті для згортання сироватки крові при 85 град. Цельсію протягом 30 хвилин.

Всі три описані тести (здатність росту на середовищах із саліциловокислим натрієм та паранітробензойною кислотою, а також тібоном) служать для відрізнення М.tuberculosis та M.bovis від атипових мікобактерій.

Варто згадати ще про один простий тест, що у комплексі з вказаними вище дозволяє диференціювати збудників туберкульозу від атипових мікобактерій - це толерантність деяких видів мікобактерій до NaCl.

3.2.1.4 Ріст на середовищі з 5 % NaCl

Принцип.

Метод грунтується на здатності атипових мікобактерій ІУ групи рости на середовищі з 5 % NaCl. Крім цієї групи, на даному середовищі ростуть тільки M.terrae complex (включає M.triviale, M.terrae, M.nonchromogenicum (III група) і M.flavescens (II група), а також деякі мікобактерії I групи (M.marinum). Всі інші мікобактерії, у тому числі M.tuberculosis і M.bovis, на цьому середовищі не ростуть.

Інгредієнти.

1. Натрій хлористий (хімічно чистий).

2. Сольова основа середовища Льовенштайна-Єнсена.

3. Яєчна суміш середовища Льовенштайна-Єнсена.

До сольової основи середовища Льовенштайна-Єнсена додають хлористий натрій із розрахунку 5,0 г на 100,0 мл сольової основи (5,0 %). Отриманий розчин стерилізують при 121 град. Цельсію 20 хвилин. Далі готують середовище, як указано в рецепті приготування середовища Льовенштайна-Єнсена.

На всі вказані вище середовища засівають по 0,2 мл зависі досліджуваної культури.

3.2.1.5 Виявлення корд-фактора

Крім росту на цих середовищах, використовують здатність мікобактерій по-різному рости на рідких живильних середовищах. Атипові мікобактерій ростуть дифузно у вигляді кучок, на відміну від істинних туберкульозних мікобактерій, що ростуть плівкою, або придонно, мають корд-фактор і ростуть у вигляді "кіс", "джгутів", "вусів" у тісному переплетенні окремих паличок одна з одною. Це може служити диференціальною ознакою. Проте, стійкі до препаратів групи ГІНК мікобактерії туберкульозу цілком або частково втрачають корд-фактор. Тому для диференціації туберкульозних культур від атипових визначення корд-фактору треба використовувати в комплексі з іншими тестами. Для відрізнення M.tuberculosis від інших мікобактерій (М.bovis і атипових мікобактерій) використовують різноманітні біохімічні методи, що у комплексі з біологічним методом дозволяють ідентифікувати культури.

3.2.2 Біохімічні методи дослідження

Для відрізнення M.tuberculosis від інших мікобактерій, а також для розрізнення М.tuberculosis від М.bovis проводять наступні визначення: 1) вміст ніацину, 2) нікотинамідазної активності, 3) нітратредуктазної активності, 4) каталазної і пероксидазної активності.

3.2.2.1 Ніациновий тест

Є одним з основних. Він дає можливість відрізнити M.tuberculosis від інших мікобактерій.

Принцип.

Відомо, що M.tuberculosis синтезують нікотинову кислоту (ніацин) у 10 разів більше, ніж M.bovis або атипові. На цій підставі були запропоновані хімічні методи визначення нікотинової кислоти за допомогою ціанистих сполук, з якими нікотинова кислота дає яскраво-жовте забарвлення. Цей тест одержав назву ніацинового.

Порівняльне вивчення різноманітних методів визначення ніацину показало, що найбільш результативним із них є модифікований метод Беніні і Лиюбоа, дещо модифікований і описаний Є.І.Тюрі і М.Є.Тюрі (Лабораторное дело. - 1964. - N 7).

Вказаний метод визначення ніацину вимагає для роботи застосування ціанистого калію, робота з яким повинна проводитися під витяжною шафою і вимагає певних умов, що обмежує широке застосування цього тесту. У зв'язку з цим, особливої уваги заслуговує метод визначення ніацину паперовими смужками, запропонований Кубика і Кильбурн, у модифікації Бараускене (Проблемы туберкулеза. - 1973).

Визначення ніацину паперовими смужками.

Перевага цього методу - у використанні замість ціанистого калію роданистого калію - речовини нелеткої і більш доступної для бактеріологічних лабораторій, а також у швидкості реакції, що дозволяє через 3-4 години дати відповідь про належність культури, що виросла на щільному середовищі, до M.tuberculosis або до інших мікобактерій.

Принцип методу полягає в екстракції ніацину з мікобактерій дистильованою водою і визначення його за допомогою паперових смужок, просочених реактивами.

Приготування реактивів.

1. 20,0 % розчин ПАСК. У пробірку наливають 1,75 мл 95% спирту, 0,25 мл диметилсульфоксиду (димексиду) і додають 400,0 мг ПАСК. Суміш підігрівають на водяній бані при 56 град. Цельсію протягом 5-10 хвилин при періодичному струшуванні до повного розчинення ПАСК.

2. 60,0 % розчин роданистого калію. Наважку 1,5 г роданистого калію розчиняють у пробірці з 2,5 мл 8,0 % розчину лимонної кислоти (200,0 мг лимонної кислоти і 2,5 мл дистильовані води).

3. 50,0 % розчин хлораміну "Б". 3,125 г хлораміну "Б" розчиняють у 6,25 мл дистильованої води на водяній бані при температурі 56 - 60 град. Цельсію при струшуванні. Гарячий розчин капають на смужки.

4. Індикаторні смужки готують із фільтрувального паперу Filtrak 11. Один кінець смужки, розміром 60 x 8 мм, відзначають простим олівцем. Відтягнутими пастерівськими піпетками на папір наносять по одній краплі свіжоприготованих реактивів у наступному порядку: 20,0 % розчин ПАСК - на позначений олівцем кінець, 60,0 % розчин роданистого калію - посередині смужки і 50,0 % розчин хлораміну УБФ - на інший кінець. Між краплями повинні залишатися сухі проміжки. Папірці висушують при кімнатній температурі в темряві протягом 24 годин, після чого зберігають їх у холодильнику в пробірках, закритих гумовими корками. Індикаторні смужки залишаються активними протягом 3-х місяців. Для одержання більш чіткої реакції рекомендується наносити повторно 1 краплю хлораміну "Б" на вже висохлу краплю.

Хід дослідження.

Водяний екстракт мікобактерій одержують шляхом додавання в пробірку з культурою 1-1,5 мл дистильованої води і витримування пробірок у горизонтальному положенні, щоб усі колонії добре відмилися водою протягом 2-3 годин у термостаті. Потім 0,6 мл екстракту мікобактерій відсмоктують мірною піпеткою в пробірку.

Індикаторну смужку поміщають кінцем, поміченим олівцем, у пробірку з 0,6 мл досліджуваного екстракту мікобактерій. Пробірку закривають гумовою коркою і погойдують, поки уся смужка не просочиться екстрактом. При позитивному ніациновому тесті через 16-30 хвилин рідина забарвлюється в яскраво-жовтий колір. Дегазація пробірки після проведення реакції здійснюється шляхом додавання 10,0 % розчину нашатирного спирту.

Використання паперових смужок для визначення ніацину дає можливість застосовувати цей тест в усіх практичних лабораторіях.

В даний час існують комерційні набори готових папірцевих смужок для проведення ніацинового тесту, що значно його спрощує і стандартизує.

3.2.2.2 Визначення амідазної активності

Принцип визначення амідазної активності базується на дезамінуванні амідів і виділенні аміаку, що визначається спеціальними реактивами. Існує два методи визначення амідазної активності - кількісний, біохімічний (за Бьоніке), і якісний, бактеріологічний (за Таке).

Метод Бьоніке

Амідний ряд, за Бьоніке, включає 10 амідів, але в лабораторній практиці можна користуватися трьома амідами: сечовина, нікотинамід і піразинамід. За Бьоніке, розчини амідів варто готувати, виходячи з наступних кількостей аміду на 100,0 мл дистильованої води: сечовина - 9,8 мг, нікотинамід - 20,0 мг, піразинамід - 20,0 мг. Хід реакції визначення амідазної активності біохімічним методом приведений на прикладі нікотинамідазної активності.

Визначення нікотинамідазної активності

Принцип.

Нікотинамідаза - це одна з ациламідаз. Вона сприяє переходові нікотинаміду в нікотинову кислоту - ніацин. При цьому звільняється аміак, що уловлюється відповідними реактивами. Наявність нікотинамідази, поряд із позитивним ніациновим тестом, свідчить про належність мікобактерій до M.tuberculosis.

Реактиви.

1. Феноловий реактив. Розчинити 25,0 г кристалічного фенолу в 10,0 мл води, додати при помішуванні 54,0 мл 25,0 % розчину NaOH (25,0 г NaOH + 75,0 мл дистильованої води) і довести об'єм до 100,0 мл. Зберігати на холоді в пляшці із темного скла.

2. Розчин гіпохлориту. Розмолоти 25,0 г хлорного вапна, просіяти і розчинити в 300,0 мл дистильованої води, додати при помішуванні 135,0 мл водного розчину вуглекислого калію (20,0 г безводної солі К2СО3 у 100,0 мл дистильованої води, попередньо прокип'яченої для видалення аміаку), старанно розмішати, швидко нагріти до 90 град. Цельсію, остудити і довести до 500,0 мл. Фільтрують невелику частину суміші і випробовують на присутність іонів кальцію. Якщо проба позитивна (розчин каламутніє), то додають ще вуглекислого калію до одержання негативної проби (розчин - прозорий). Профільтрувати суміш і зберігати розчин у холодильнику, у невеликих пляшках із темного скла. Реактив може зберігатися в холодильнику 1-2 місяці.

3. Водний розчин нікотинаміду - 200,0 мкг/мл. Для цього 20,0 мг нікотинаміду розчиняють у 100,0 мл дистильованої води.

4. 1/15 М фосфатний буфер, рН-7, 2.

5. 0,07 % MnSO4.

Хід дослідження.

До 0,5 мл густої бактеріальної зависі (20,0 мг/мл змішують за допомогою струшувача типу ВОРТЕКС у 0,5 мл 1/15 М фосфатного буфера, рН-7,2), додають 0,5 мл розчину нікотинаміду. Суміш витримують у термостаті 15-16 годин. Потім визначають аміак по Расселу. Для цього до суміші додають 0,2 мл 0,07 % MnSO4, 2,0 мл фенолового реактиву в 1 мл гіпохлориту. Пробірки поміщають у водяну баню при 100 град. Цельсію на 15-20 хвилин. Поява синьо-зеленого забарвлення свідчить про наявність у середовищі аміаку, отже, про належність культури до M.tuberculosis. Контролем є пробірка з 0,5 мл нікотинаміду і 0,5 мл буферу, яку також поміщають у термостат. У контрольній пробірці реакція на аміак повинна бути негативною. У випадку появи блідо-блакитного забарвлення воно враховується при оцінці результатів у дослідній пробірці.

Метод Таке

Іншим способом визначення амідазної активності є бактеріологічний якісний тест Таке.

Принцип методу полягає в появі специфічного іржавого забарвлення при додаванні реактиву Несслера до зрілих культур МБТ, які виросли на агаровому середовищі, яке містить аміди, що і є свідченням про достатнє утворення ацетиламідази мікобактеріями в процесі їх росту.

Реактиви.

1. Нікотинамід.

2. Піразинамід.

3. Сечовина.

4. Реактив Несслера.

5. Агарове середовище: пептон, натрій хлористий, глюкоза, калій фосфорнокислий однозаміщений (KH2PO4), гліцерин.

Хід дослідження.

Приготування агарового середовища: 1,0 г пептону, 20,0 г агар-агару або агару Діфко, 5,0 г NaCl, 0,1 г глюкози, 2,0 г KH2PO4, 10,0 мл гліцерину розчиняють у дистильованій воді при нагріванні, доводячи кінцевий об'єм до 1,0 літра, рН - 6,9. Гаряче середовище розливають по пробірках і автоклавують при 120 град. Цельсію 30 хвилин. Після стерилізації агар у пробірках скошують. Готують розчини амідів у дистильованій воді: сечовина - 40,0 мг/мл, нікотинамід - 30,0 мг/мл, піразинамід - 20,0 мг/мл.

Розчини нікотинаміду і піразинаміду стерилізують у водяній бані при 100 град. Цельсію протягом 30 хвилин. Розчин сечовини фільтрують через бактеріальний фільтр (Зейця). Стерильний розчин амідів вносять по 0,25 мл у пробірки з живильним середовищем і лишають останні в горизонтальному становищі 2-3 доби, так, щоб розчин всмоктався в поверхню живильного середовища. (За підрахунками, кількість сечовини, нікотинаміду і піразинаміду на 1,0 кв. см поверхні середовища складає відповідно - 1000, 750 і 500 мкг/кв. см).

У пробірки з амідами засівають 0,2 мл густої зависі культури випробовуваних мікобактерій (1,0 мг/мл). Посіви інкубують при 37 град. Цельсію. Як тільки з'явиться ріст (через 2-3 тижні) додають 0,5 мл реактиву Несслера. Поява іржавого забарвлення свідчить про позитивну реакцію (про наявність у бактерій відповідної амідази). Контролем є посіви в пробірках без амідів.

Різні види мікобактерій відрізняються по ферментативній активності стосовно різних амідів. Ці розходження подані в табл. 3.2.

Таблиця 3.2 - Амідазна активність окремих видів мікобактерій

Група За Раньоном	Види	Аміди
Група За Раньоном	*Мікобактерій*	*Сечовина*	*Нікотинамід*	*Піразинамід*
-	М. Tuberculosis	+	+	+
-	M. Bovis	+	-	-
I	M. Kansasii	+	+	-
II	M. Gordonae (m. Aquae)	-/+	-	-
II	M. Scrofulaceum	+	+	+
III	M. Avium	-	+	+
III	M. Xenopi	-	+	+
III	M. Intracellulare	-	+	+
III	M. Terrae	-	+	+
IV	M. Fortuitum	+	+/-	+/-
IV	M. Smegmatis	+	+	+
IV	M. Phlei	+	+	+

Позначення:

+ реакція позитивна,

- реакція негативна,

+/- реакція може бути позитивною або негативною

Для штамів кислотостійких сапрофітів, що швидко ростуть (IV група), характерною є наявність формамідазної активності. Цей фермент відсутній у M.tuberculosis й у більшості атипових мікобактерій, які класифіковані за Раньоном.

Принцип реакції полягає в здатності формамідази розщеплювати формамід з утворенням аміаку, виділення якого уловлюється в реакції з фенолом і гіпохлоритом.

Хід дослідження (модифікована методика Дихно) аналогічний реакції на нікотинамідазу.

Використовується 0,2 мл формаміду на 250,0 мл дистильованої води. Для проведення реакції необхідно мати інгредієнти високої якості.

3.2.2.3 Визначення нітратредуктазної активності

При диференціюванні мікобактерій туберкульозу користуються також реакцією відновлення нітратів у нітрити. Реакція відновлення нітратів дає можливість диференціювати M.tuberculosis, які мають нітратредуктазу, від M.bovis, M.avium і від деяких атипових, у яких цей фермент відсутній. Виняток складають фотохромогенні мікобактерії (М. kansasii) і деякі з III і IV груп.

Принцип.

Активність нітратредуктази визначається по кількості відновленого з нітрату нітриту, що дає кольорову реакцію з пара-диметиламінобензальдегідом.

Реактиви.

1. 0,067 М фосфатний буфер (рН-7, 1), що містить 0,1 % нітрату натрію.

2. 2,0 % розчин (вага/об'єм) пара-диметиламінобензальдегіду в 10,0 % HCl.

3. 10,0 % розчин соляної кислоти.

Для реакції використовують 3-4-тижневі культури, вирощені на яєчному середовищі.

Хід дослідження.

50,0 мг вологої ваги 3 - 4-тижневої культури суспендують в 5,0 мл (можна суспендувати 10,0 мг культури в 1,0 мл) 0,067 М фосфатного буферу (рН - 7,1), що містить 0,1 % нітрату натрію, і інкубують при 37 град. Цельсію 15 - 16 годин. Утворення нітриту перевіряється додаванням 2 крапель 2,0 % розчину пара-диметиламінобензальдегіду в 10,0 % HCl + 1,0 мл 10,0 % HCl. Поява жовтого забарвлення свідчить про належність культури до M.tuberculosis (метод Тсукамура).

Крім активності вказаних ферментів для відрізнення M.tuberculosis від інших кислотостійких мікобактерій можна використовувати різну активність окисно-відновних ферментів.

3.2.2.4 Диференціація мікобактерій за окисно-відновними ферментами

У окисно-відновних процесах мікробної клітини активну участь приймають такі ферменти, як каталаза і пероксидаза. У M.tuberculosis і M.bovis, чутливих до препаратів групи ГІНК (гідразиду ізонікотинової кислоти), виявляється активність обох ферментів паралельно. При цьому у чутливих культур спостерігається швидке активне виділення пухирців кисню, обумовлене діяльністю каталази, і забарвлення колоній у темно-коричневий колір, обумовлене діяльністю пероксидази. Поява коричневого пігменту пояснюється переходом пірогалолу в пурпурогалин в присутності перекису водню під впливом пероксидази. У культур M.tuberculosis, стійких до препаратів групи ГІНК, активність цих ферментів різко знижена, при визначенні каталазної активності пухирці кисню виділяються в невеликій кількості, повільно або майже відсутні, а при визначенні активності пероксидази колонії або ледь забарвлюються, або (при високому ступені стійкості до ізоніазиду) залишаються безбарвними. На відміну від M.tuberculosis, у атипових мікобактерій, незалежно від стійкості до ГІНК, каталазна активність завжди різко позитивна, пероксидазна ж, як правило, не виявляється.

Визначення каталазної і пероксидазної активності одночасно (модифікована методика Богена)

Принцип каталазної реакції полягає в розщепленні перекису водню ферментом каталазою на воду й атомарний кисень, що супроводжується виділенням пухирців кисню і переходом пірогалолу в пурпурогалин в присутності перекису водню під впливом пероксидази.

Реактиви.

1. 0,5 % пірогалол: 50,0 мг чистого пірогалолу розчинити в 10,0 мл дистильованої води. 2. 2,0 % пергідроль. 0,2 мл пергідролю розвести в 10,0 мл дистильованої води. Обидва розчини готують безпосередньо перед дослідом, змішують і наливають у пробірку так, щоб покрити культуру.

Хід дослідження.

Обидва розчини зливають у колбу в рівній кількості і наливають по 6,0 - 8,0 мл суміші у пробірку з культурою. В залежності від кількості культур, що перевіряють, об'єм розчинів, які готуються, відповідно збільшують.

Облік реакції активності каталази проводять через 5 хвилин по активному виділенню пухирців кисню. Реакцію на пероксидазу враховують через 1,5-2 години по забарвленню колоній у темно-коричневий колір.

Ступінь активності каталази позначають по 3-бальній системі: - +++ рясне виділення пухирців кисню в 1-шу хвилину;

- ++ помірне виділення пухирців кисню;

- + поодинокі пухирці. При відсутності пухирців реакція вважається негативною ( - ).

Активність пероксидази оцінюється також по 3-бальній системі:

- +++ темно-коричневе забарвлення колоній;

- ++ коричневе забарвлення колоній;

- + блідо-коричневе забарвлення колоній.

При негативній реакції колір колоній не змінюється.

Цінною реакцією для відрізнення M.tuberculosis від атипових мікобактерій є проба на термостабільність каталази.

Термостабільність каталази

Каталаза у кислотостійких мікобактерій різна. У вірулентних мікобактерій вона швидко і легко руйнується при нагріванні до 65 - 68 град. Цельсію. У атипових мікобактерій і кислотостійких сапрофітів вона термостабільна.

Визначення активності термостабільної каталази

Готують 3,0 мл густої зависі мікобактерій. 1,5 мл зависі переносять у центрифужну пробірку, яку нагрівають на водяній бані при 68 град. Цельсію протягом 10 хвилин. Потім пробірку охолоджують і на предметне скло наносять по 1 краплі зависі: на один кінець - непрогріту (служить контролем), на другу - завись після нагрівання. До цих двох зависів додають по 1 краплі пергідролю. Утворення пухирців свідчить про активність ферменту, відсутність - про пригнічення. На підставі цієї реакції легко відрізнити M.tuberculosis, у яких каталаза завжди термолабільна, від більшості атипових і кислотостійких сапрофітів із різко термостабільною каталазою.

Термостабільність каталази, так само як і її активність, враховується по 3-бальній системі.

Співвідношення окисно-відновних ферментів у різних видів мікобактерій показане в табл.3.3.

Таблиця 3.3 - Ідентифікація мікобактерій по окисно-відновним ферментам і ніациновій пробі

Мікобактерії	Каталаза	Пероксидаза	Термостабільність каталази	Ніацинова проба
Атипові	+ + +	-	+	-
M.tuberculosis, чутливі до ізоніазиду	+++	+	-	+
M.tuberculosis, стійкі до ізоніазиду	+, + -	-	-	+
M.bovis	+ +	+ +	-	-

3.2.2.5 Реакція гідролізу твіну-80

Важливою реакцією для ідентифікації мікобактерій всередині II і III груп (за Раньоном), є реакція гідролізу твіну-80. Твін-80 зв'язує нейтральний червоний, і суміш до реакції має солом'яно-жовтий колір. Принцип реакції - у ензимному гідролізі твіну-80. При цьому відбувається звільнення нейтрального червоного і забарвлення відновлюється від рожевого до червоного. Позитивна реакція відзначається у M.aquae (на відміну від M.scrofulaceum, у яких реакція негативна), а з III-ї групи вона позитивна тільки у M.terrae.

Реактиви.

1. 1/15 М фосфатний буфер (рН - 7) - 100,0 мл.

2. Твін - 80 - 0,5 мл.

3. Основний нейтральний червоний, 0,1 % - 2,0 мл. Краще розчинити 0,1 г нейтрального не в 100,0, а в 85,0 мл дистильованої води.

Змішати усі три реагенти. Розлити по 4,0 мл у пробірки й автоклавувати при 120 град. Цельсію 15 хвилин. Протягом доби перевіряють на стерильність у термостаті і зберігають у холодильнику. Стабільність розчину - не більше 2-х тижнів.

Хід дослідження.

Емульгують 3 бактеріологічні лопатки культури в пробірках із приготованим субстратом (твін-80 із нейтральним червоним). Пробірки поміщають у термостат. Реакцію перевіряють через 4 години, на 5-у і 10-у добу. Тест вважається позитивним, якщо рожево-червоне забарвлення з'явилося до 10-ої доби, негативним, якщо забарвлення не з'явилося (модифікована методика Вайна). Контролем є пробірка з середовищем без реактивів.

3.2.2.6 Ключові тести і схеми ідентифікації мікобактерій

При описанні біохімічних тестів ми зупинилися на найбільш простих пробах, що дають можливість відрізнити M.tuberculosis від атипових і розрізняти деякі види атипових мікобактерій всередині груп Раньона. При диференціації мікобактерій варто пам'ятати, що, крім використання комплексу тестів, застосованих при вивченні атипових культур, необхідно користуватися обов'язковими для кожного виду тестами (так звані ключові тести), проведення яких полегшує ідентифікацію культур. Наводимо ключові тести для окремих видів мікобактерій (табл.3.4).

Крім перерахованих тестів, для всіх безпігментних культур необхідно визначати ніацинову пробу, і якщо вона негативна, перевіряти амідазну активність. Використання описаних тестів дає можливість розділити атипові культури на патогенні для людини і випадкові супутні сапрофіти, які не впливають на захворювання.

Для клініки особливе значення мають наступні види атипових мікобактерій:

M.kansasii, M.marinum, M.scrofulaceum , M.xenopi,

M.avium, M.intracellularae, M.fortuitum

Для атипових мікобактерій, крім вказаних нами особливостей (швидкості росту, пігментоутворення, морфології колоній і паличок, температурного оптимуму) характерними являються: негативна ніацинова проба, відсутність пероксидазної активності при високій активності каталази, виражена термостабільність каталази у більшості мікобактерій, ріст на живильних середовищах із паранітробензойною кислотою і саліциловокислим натрієм, відсутність в більшості випадків корд-фактору. Характерним також для атипових мікобактерій є первинна стійкість до більшості антимікобактеріальних препаратів.

Для відрізнення М.tuberculosis і М.bovis від нетуберкульозних мікобактерій, відмінності їх один від одного, а також для розрізнення атипових мікобактерій всередині груп зручно користуватися розміщеними нижче схемами.

Види мікобактерій	Тести	Результати тесту, властиві для даного виду мікобактерій
M.tuberculosis
	Швидкість росту	Повільний
	Ніацин	+
	Відновлення нітратів	+
	Каталаза при 68 град. Цельс.	-
	Утворення пігменту в темряві	-
	Ріст на середовищі з 500 мкг/ мл ПНБ	-
M.bovis	Швидкість росту	Повільний
	Ніацин	-
	Відновлення нітратів	-
	Каталаза при 68 град. Цельс.	-
	Утворення пігменту в темряві	-
	Ріст на середовищі з 500 мкг/ мл ПНБ	-
M.kansasii	Швидкість росту	Повільний
	Відновлення нітратів	+
	Каталаза при 68 град. Цельс.	+
	Утворення пігменту після освітлення	+
	Гідроліз твіну-80	+
M.scrofulaceum	Швидкість росту	Повільний
	Каталаза при 68 град. Цельс.	+
	Утворення пігменту в темряві	+
	Гідроліз твіну-80	-
M. Gordonae (m.aquae)	Швидкість росту	Повільний
	Каталаза при 68 град. Цельс.	-
	Утворення пігменту в темряві	+
	Гідроліз твіну-80	+
M.xenopi	Швидкість росту	Повільний
	Каталаза при 68 град. Цельс.	-
	Утворення пігменту в темряві	+
	Гідроліз твіну-80	-
M.avium	Швидкість росту	Повільний
	Ніацин	-
	Відновлення нітратів	-
	Гідроліз твіну-80	-
M.intracellulare	Швидкість росту	Повільний
	Ніацин	-
	Відновлення нітратів	-
	Гідроліз твіну-80	-
M.gastri	Швидкість росту	Повільний
	Ніацин	-
	Відновлення нітратів	-
	Каталаза при 68 град. Цельс.	-
	Утворення пігменту на світлі	-
	Гідроліз твіну-80	+
M.terrae	Швидкість росту	Повільний
	Ніацин	-
	Відновлення нітратів	+
	Каталаза при 68 град. Цельс.	-
	Утворення пігменту на світлі	+
	Гідроліз твіну-80
M.fortuitum	Швидкість росту	Швидкий
	Відновлення нітратів	+
	Утворення пігменту в темряві	-
	Толерантність до 5 % NaCl	+
M.smegmatis	Швидкість росту	Швидкий
	Утворення пігменту в темряві	-
	Толерантність до 5 % NaCl	+
M.phlei	Швидкість росту	Швидкий
	Утворення пігменту в темряві	+
	Толерантність до 5 % NaCl	+

Схема 3.1 - основні тести для відрізнення m.Tuberculosis, m.Bovis від інших мікобактерій

Тести	М.Tuberculosis	М.bovis	Інші Мікобактерії
Ніациновий тест	+	-	-
Ріст на середовищі льовенштайна-єнсена із 500,0 мкг/мл паранітробензойної кислоти або саліциловокислого натрію	-	-	+
Реакція на термостабільність каталази	-	-	+
Каталазна активність у гінк-резистентних штамів	+, + -, -	+, - +, -	+ + +

Схема 3.2 - основні тести, що відрізняють m.Tuberculosis від m.bovis

Тести	M. Tuberculosis	M. Bovis
Ніацинова проба	+	-
Нікотинамідаза	+	-
Відновлення нітратів	+	-

Схема 3.3 - I група - фотохромогенні мікобактерії

-	25 град. Цельсію	37 град. Цельсію	45 град. Цельсію	Відновлення нітратів	Гідроліз твіну-80
M.kansasii	+	+ -	-	+	+
M.simiae	+	+ -	-	-	+
M.marinum	+	+ -	-	-	-

Для розрізнення всередині групи необхідні наступні тести: утворення пігменту, гідроліз твіну-80, ніацинова проба (M.simiae + -), відновлення нітратів, ріст при 25 і 37 град. Цельсію.

Схема 3.4 - II група - скотохромогенні мікобактерії

Штами	25 град. Цельсію	37 град. Цельсію	45 град. Цельсію	Відновлення нітратів	Уреаза	Гідроліз твіну - 80
M.aquae (m.gordonae)	+	+ -	-	-	+	+
M.aquae	+	+ -	-	-	-	+
M.scrofulaceum	+	+ -	-	-	+	-

Схема 3.5 - III група - нефотохромогенні мікобактерії (основі тести)

-	25 град. Цельсію	45 град. Цельсію	Відновлення нітратів	Гідроліз твіну - 80	Каталаза 68 град. Цельс.	Амідазна активність
M.avium	+ -	+ -	-	-	+	Н; п
M.intracellu lare	+ -	+ -	-	-	+	Н; п
M.terrae	+	-	+	+	+	0
M.triviale	+	-	+	+	+	Н; п; 0*
M.xenopi	-	+	-	-	+	Н; п

m. Terrae вайна - 0; M.terrae Тсукамура - Н; П

Н - нікотинамід,

П - піразинамід,

0 - негативна реакція.

Схема 3.6 - IV група - мікобактерії, що швидко ростуть (основні тести)

-	25 град. Цельсію	37 град. Цельсію	45 град. Цельсію	52 град. Цельсію	Гідроліз твіну - 80
M.fortuitum	+	+	-	-	+ -
M.phlei	+	+	+	+	+
M.smegmatis	+	+	+	-	+

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

_{Home •
Поиск •
Про институт • Новости •
Наши издания •
Оригинальные статтьи •
Нововведения

Патенты
• Отчеты о НДР •
Подготовка кадров • Научные
форумы

Информация для специалистов •
Информация для населения
• Медицинские услуги}

www.ifp.kiev.ua