2. Методи виявлення мікобактерій туберкульозу 

2.1 Деякі біологічні особливості роду Mycobacterium (21 group Berge'ss Manual Determinative Bacteriology, Ninth Edition) 

Мікробіологічні дослідження є одним з найбільш важливих діагностичних тестів при захворюваннях органів дихання, що сприяють своєчасній діагностиці збудника інфекційного процесу, визначають особливості клінічної симптоматики, дозволяють орієнтувати лікаря на ймовірний діагноз і перебіг хвороби, диктують вибір препарату для проведення адекватної антибактеріальної хіміотерапії. 

До складу роду Micobacterium сімейства Micobacteriaceae включені кислото- і спиртостійкі (ознака особливо виражена у патогенних видів) аеробні нерухомі грампозитивні прямі чи вигнуті паличкоподібні бактерії. Іноді вони утворюють нитковидні чи міцеліальні структури, які фрагментуються при легкому механічному впливі, на палички чи кокоподібні елементи. Для них характерним є високий вміст ліпідів і восків (до 60,0 %) у клітинних стінках, утворених пептидогликано-арабіногалактановим комплексом; деякі види утворюють каратиноїдні пігменти, що не дифундують. Каталазо - і арилсульфатазопозитивні, резистентні до дії лізоциму. Ростуть повільно, чи дуже повільно (сапрофітні види значно швидше). Мікобактерії широко поширені в навколишньому середовищі - воді, їрунті, у рослин і тварин. Незважаючи на те, що в даний час ідентифіковано близько 50 видів, рід нараховує близько 200 видів; типовий вид - Mycobacterium tuberculosis. За ознакою патогенності виділяють власне патогенні, що спричиняють конкретні захворювання, і атипові мікобактерії, серед яких є умовно-патогенні і сапрофітні. Для систематики атипових мікобактерій запропоновані різні класифікації, засновані на генетичній спорідненості з M. tuberculosis чи спорідненості з сапрофітними видами; серед запропонованих варіантів найбільше поширення знайшла класифікація Раньона (1959), в основу якої покладені дві властивості - колір колоній і швидкість росту. Відповідно вона виділяє 4 групи атипових мікроорганізмів. 

У лабораторній практиці основними методами індикації й ідентифікації різних мікобактерій є бактеріоскопічний метод дослідження (пряма мікроскопія, мікроскопія після збагачення, люмінесцентна мікроскопія, фазовоконтрастна мікроскопія), культуральний метод (швидкість росту, форми колоній і мікроколоній, здатність до утворення пігменту, ріст при різних температурах, здатність до росту на МПА, толерантність до NaCl і деякі біохімічні особливості, що представлені нижче) і біологічний метод. Мікроскопія і бактеріологічний метод проводяться одночасно. 

M.tuberculosis - тонкі, прямі чи злегка вигнуті палички розмірами 1,0 - 10,0 х 0,2-0,6 мкм, зі злегка закругленими кінцями, у цитоплазмі містять зернисті утворення (2-10). Морфологія істотно варіює в залежності від віку культури й умов культивування - в молодих культурах палички довші, а в старих схильні до простого розгалуження. Іноді утворюють коковидні структури і L-форми, що зберігають патогенність, а також фільтрівні форми, патогенна роль яких залишається недостатньо вивченою. 

Нерухомі, спор не утворюють, позбавлені капсул, але мають мікрокапсулу, яка відокремлена від клітинної стінки осмієфобною зоною. 

Кислотостійкі, що обумовлено високим вмістом ліпідів і міколової кислоти в клітинній стінці, а також утворюють кислотолабільні гранули, які переважно складаються з метафосфату (зерна Муха), розташовуються вільно або в цитоплазмі паличок. Грампозитивні, анілінові фарби сприймають погано; за Цілем-Нільсеном забарвлюються в яскраво-червоний колір; за Мухом-Вайссом - у фіолетовий (йодофільність); гранули забарвлюються у відповідний колір. 

Аероби, але здатні рости у факультативно анаеробних умовах; 5,0 - 10,0 % вмісту СО2 сприяє більш швидкому росту. Розмножуються повільно, в середньому 14-18 годин. Температурний оптимум 37 - 38 град. Цельсію; потреба в рН 7,0-7,2 (але можуть рости в межах 4,5-8,0). Для росту мають потребу в присутності білкового субстрату і гліцерину, а також вуглецю, хлору, сірки, фосфору, азоту, факторів росту (біотину, нікотинової кислоти, рибофлавіну й ін.), іонів (Mg++, K+, Na+, Fe++). Для вирощування найчастіше використовують щільні яєчні середовища (Льовенштайна-Єнсена, Фінна-2 й ін.). На рідких середовищах ріст спостерігають на 5-7 добу у вигляді сухої зморшкуватої плівки (R - форма), що підіймається на стінки пробірки; середовище залишається прозорим. У середовищах, що містять детергент (твін-80), дають рівномірний ріст по товщі середовища (особливо при періодичному струшуванні). На рідких середовищах і при внутрішньоклітинному розвитку добре виявляється характерний корд-фактор (тригалоза-6,6-димиколат), що обумовлює зближення бактеріальних клітин у мікроколоніях, їх ріст у вигляді серпантиноподібних утворень ("кіс") і має відношення до вірулентності збудника. На щільних середовищах відзначають ріст у вигляді сухого зморшкуватого нальоту кремового кольору; колонії з піднятим центром, що нагадують цвітну капусту, крихкуваті, погано змочуються водою. Колонії легко знімаються з середовища, а при прожарюванні тріскотять. Під впливом антибактеріальних препаратів можуть дисоціювати з утворенням м'яких вологих S - колоній або рости у вигляді гладких чи пігментованих колоній. Відмінна риса M.tuberculosis - здатність до синтезу значної кількості нікотинової кислоти (ніацину), це використовують для її диференціальної діагностики з іншими мікобактеріями (ніациновий тест); одна з умов - необхідність посіву на середовище Льовенштайна-Єнсена, що не містить малахітового зеленого (тому що барвник вступає в реакцію з реагентами, що використані). На середовищах з жовчю утворюють сіруватий маслянистий наліт, обумовлений подовженими паличками. 

Проведення широкого комплексу мікробіологічних досліджень обумовлено зміною епідеміологічної ситуації, патоморфозом туберкульозу, зміною ряду властивостей збудника, що утруднюють мікробіологічну діагностику туберкульозу. 

До числа їх належить: 

ь олігобацилярність хворих, що виражається як невеликим числом мікобактерій у діагностичному матеріалі, так і епізодичністю бактеріовиділення. У зв'язку з цим достовірна діагностика бактеріовиділення повинна грунтуватися на серії мікробіологічних досліджень; 

ь зміна культуральних властивостей мікобактерій, втрата ними здатності до росту на деяких штучних живильних середовищах. Тому посів діагностичного матеріалу необхідно проводити не менш, ніж на два різні живильні середовища, чи використовувати попереднє підрощення на рідких живильних середовищах; 

ь зміна тинкторіальних властивостей збудника, втрата мікобактеріями кислотостійкості і пов'язана з цим недостатня інформативність бактеріоскопічних методів дослідження при фарбуванні за Цілем-Нільсеном. Додаткове використання люмінесцентної мікроскопії і комплексність мікробіологічного дослідження дозволяють виключити цю проблему; 

ь збільшення ролі неспецифічної мікрофлори у виникненні супутніх захворювань і ускладнень при туберкульозі. У ряді випадків, особливо у хворих з неясною етиологією захворювання, мікробіологічна ідентифікація збудника повинна проводиться за життєвими показаннями, інтервал між одержанням матеріалу від хворого і посівом його на відповідні живильні середовища має бути максимально коротким і не перевищувати 2 години. 

З метою встановлення бактеріовиділення чи його відсутності кожен хворий повинен бути комплексно обстежений: дослідження харкотиння (промивних вод бронхів, трахеї, шлунку чи ін.) не менше трьох разів методом бактеріоскопії, трьохразовий посів перед початком лікування у вперше виявленого хворого, або при загостреннях і рецидивах процесу. 

В період лікування зазначені дослідження (бактеріоскопія мазка і посів досліджуваного матеріалу) проводяться за схемою 2.1 до закінчення основного курсу хіміотерапії. 

Схема 2.1 - Кратність обстеження хворого на вперше виявленний туберкульоз легень в динаміці хіміотерапії

Примітки: 

БС - бактеріоскопія; 

* - якщо наприкінці 2-го місяця лікування результати бактеріоскопії мазка КСП+ (в мазку наявні КСП), є необхідним проведення бактеріоскопії наприкінці 3-го місяця лікування; 

** - якщо наприкінці 6-го місяця лікування результати бактеріоскопії мазка КСП+ (в мазку наявні КСП), є необхідним проведення бактеріоскопії наприкінці 8-го місяця лікування. 

В період лікування обстеження проводится після дводенної перерви в прийомі антимікобактеріальних препаратів. 

2.2 Бактеріоскопічні методи виявлення мікобактерій туберкульозу 

Бактеріоскопічний метод дослідження залишається одним з основних. Перевага цього методу - в його швидкості. Але можливості його обмежені: при прямій бактеріоскопії мазка, забарвленого за Цілем-Нільсеном, мікобактерії туберкульозу можуть бути виявлені тільки при дуже великій їх кількості - 5 000 - 10 000 бактеріальних клітин і більше в 1,0 мл патологічного матеріалу. Хворі, особливо в процесі антибактеріальної терапії, часто виділяють мікобактерії в значно меншій кількості, тоді цей метод може виявитися недостатньо чутливим для їхнього виявлення. У таких випадках застосовують методи "збагачення" патологічного матеріалу. 

Приводимо методику прямої мікроскопії мазка за Цілем-Нільсеном (п.2.2.1). Метод прямої мікроскопії мазка за Цілем-Нільсеном доцільно використовувати як попереднє дослідження, однак у світовій практиці і за рекомендаціями ВООЗ у даний час досліджується осад патологічного матеріалу, який отримується після попередньої гомогенізації матеріалу з наступним його центрифугуванням (метод збагачення). 

2.2.1 Пряма бактеріоскопія мазка з фарбуванням за Цілем - Нільсеном Принцип методу грунтується на здатності M.tuberculosis після забарвлення їх фуксином при прогріванні утримувати барвник навіть після тривалого знебарвлення в сірчаній кислоті або в солянокислому спирті.

  Реактиви 

1. 1,0 % розчин основного фуксину (1,0 г основного фуксину розтирають із 2-3 краплями гліцерину, додають по краплі 10,0 мл 96 % етилового спирту і 90,0 мл 5,0 % розчину фенолу (5,0 г кристалічного фенолу або карболової кислоти в 100,0 мл дистильованої води)). 

Розчин лишають на добу, потім фільтрують через паперовий фільтр. Зберігають у темному місці при кімнатній температурі в добре закритому посуді. 

2. Знебарвлюючі розчини: 20,0 % сірчана кислота (20,0 мл концентрованої H2SO4 додають до 80,0 мл стерильної дистильованої води); 3,0 % солянокислий спирт (3,0 мл концентрованої соляної кислои додають до 97,0 мл 70 % етилового спирту). 

3. Дофарбовуючий розчин: 0,25 % метиленового синього (0,25 г метиленового синього на 1,0 л дистильованої води). 

4. Фільтрувальний папір. Всі розчини маркуються і зберігаються в посуді з темного скла при кімнатній температурі протягом 6-12 місяців. 

Спеціальне обладнання 

Мікроскоп з імерсійним об'єктивом 

Газовий або спиртовий пальник 

Предметні скельця 

Дерев'яна паличка

Хід дослідження 

Приготування мазка харкотиння.

Візьміть нове, чисте предметне скельце без подряпин й напишіть з одного боку шифр пацієнта. 
к
Перенесіть необхідну кількість досліджуваного матеріалу за допомогою аплікатора або бактеріологічної петлі. Для приготування мазків використовуйте непрозорі, сіруваті або жовтуваті творожисті маси, які присутні в харкотинні. 
к
Матеріал необхідно розподілити по предметному скельцю тонким шаром на площі приблизно 1,0 см на 2,0 см. Мазок повинен бути достатньо тонким, щоб його можна було легко мікроскопіювати. На кожному предметному скельці повинно бути не більше одного мазка.
к 
Залишіть мазок для підсихання на 15 хв. при кімнатній температурі. Не підсушуйте мазок підігріванням.
 к 
Фіксуйте препарати, використовуючи один із наступних методів: 

- Проведіть скельце (мазком догори) через полум'я 3-4 рази. Не перегрівайте мазок. Перед забарвленням мазок необхідно охолодити. 

- Фіксуйте мазки не менше 2 годин на електронагрівачі для сушки предметних скелець (при температурі + (65 - 75) град. Цельсію). 

Цінність мазків при дослідженні іншого біологічного матеріалу (не з легень) 

Так як туберкульозні бактерії можуть вражати майже будь-які органи, лабораторія може отримувати для дослідження різноманітний матеріал, наприклад, біологічні рідини, тканини, гній та сечу. Результати бактеріоскопічного дослідження цих матеріалів мають обмежене значення, тому в таких випадках рекомендується використовувати культуральний метод дослідження. 

Промивні води шлунка. Не слід використовувати проби промивних вод шлунка для приготування мазків, так як при цьому можуть бути отримані некоректні результати. Кислотостійкі сапрофітні бактерії нерідко присутні у воді та в харчових продуктах, з якими вони можуть потрапити в шлунок. При бактеріоскопічному дослідженні неможливо віддиференціювати такі мікроорганізми від туберкульозних бактерій. 

Мазок з гортані. Мікроскопія мазків з гортані не представляє цінності. Негативні результати нічого не значать, тому краще зберегти такий матеріал для культурального дослідження. 

Гній та густий аспірат. Мазки з такого матеріалу повинні бути дуже тонкими. Товсті мазки звичайно змиваються з предметних скелець, а якщо вони й зберігаються на склі, то все одно після забарвлення дуже важко віддиференціювати кислотостікі бактерії. Труднощі можуть виникнути й при наявності в мазку великої кількості крові, так як іноді елементи крові можуть бути причиною утворення кислотостійких артефактів. 

Плевральна рідина. Матеріал з плевральної рідини повинен бути відцентрифугований, після чого для приготування тонкого мазку використовують осад. 

Спиномозкова рідина. Мікроскопія мазків із спиномозкової рідини рідко дає позитивні результати, а осад концентрованої рідини краще використовувати для посіву. 

Сеча. Мікроскопія мазків із осаду відцентрифугованої сечі не дозволяє отримати достовірні результати, тому бактеріоскопічне дослідження сечі проводити недоцільно. 

Фарбування мазків.

Помістіть маркіровані предметні скельця на підставку ("санчата") групами (максимально по 12 штук) так, щоб вони не торкалися один одного
к
Налийте на кожне скло достатню кількість розчину Ціля-Нільсена (карбол-фуксину), який був профільтрований перед використанням, або накрийте кожний препарат стрічкою фільтрувального папірця, якщо розчин перед використанням не фільтрувався.
 к
Обережно підігрівайте препарат до появи парів. Не доводити до кипіння. Ні в якому разі не доводьте до повного випарювання рідини. 
к
Якщо були використані стрічки фільтрувального папірця, необхідно видалити їх пінцетом. Обережно промийте скельце під струменем води до повного видалення барвника. 
к
 Нанесіть знебарвлюючий розчин (максимум на 3 хв.). 
к
Ретельно промийте скельце водою. Видаліть залишки води.
к
 Нанесіть на предметне скельце дофарбовуючий розчин (на 30-60 сек.). 
к
 Ретельно промийте скло водою. Видаліть залишки вологи. Залишіть мазок сохнути на повітрі. Не промокайте препарат. 
к
 Примітка: Для запобігання отримання хибнопозитивних результатів бактеріоскопії рекомендується знебарвлюючі та дофарбовуючі розчини наносити безпосередньо на мазок. Слід відмовитися від занурення скелець з мазками в посуд із знебарвлюючими та дофарбовуючими розчинами. 

Оцінка результатів. 

Препарат мікроскопують під імерсією. На перегляд препарату звичайно потрібно біля 15 хвилин. Цього часу достатньо, щоб виявити поодинокі мікобактерії в препараті. В цьому випадку необхідно переглянути не менш 300 полів зору. 

В останній час при мікроскопії можна спостерігати морфологічні і тінкторіальні зміни M.tuberculosis під впливом антимікобактеріальних препаратів, що приводить до утруднення диференціації їх від атипових і сапрофітних мікобактерій. Відомо, що М.tuberculosis можуть частково змінювати кислотостійкість, набувати кокоподібної, сегментоподібної форми, а також подвійних коків, розташованих бобоподібно, як всередині лейкоцитів, так і самостійно. Це ускладнює їх диференціацію. 

Кількість мікобактерій в мазку (або колоній в пробірці при культуральному методі дослідження) в процесі антимікобактеріальної терапії є орієнтовним показником її ефективності або непрямим свідченням розвитку стійкості мікобактерій до антимікобактеріальних препаратів. Якщо в процесі лікування кількість мікобактерій у препараті не зменшується в порівнянні з початковим - терапію хворого варто змінити. 

Дуже важливо визначити живі чи неживі мікобактерії, оскільки вирішити це питання неможливо шляхом фарбування мазка за Цілем-Нільсеном. З цією метою приготований мазок фіксують над полум'ям, фарбують 1,0 % розчином малахітового зеленого протягом 5 - 10 хвилин, підігріваючи мазок до появи парів. Після цього фарбу зливають, мазок промивають водою і забарвлюють карболовим фуксином (в розведенні 1:5) протягом 5 хвилин. При цьому живі мікобактерії фарбуються в зелений колір, а нежиттєздатні - в червоний. Цитохімічний метод визначення життєздатності мікобактерій застосовують для проб з великою кількістю мікобактерій. 

Предметні скельця використовуються лише нові. Мазки з позитивними результатами знищують в установленому порядку, так як на скельцях можуть зберігатися мікобактерії попередніх аналізів.

2.2.2 Метод збагачення 

У випадку відсутності мікобактерій при прямому мікроскопічному дослідженні та при наявності клінічних ознак туберкульозу застосовують різні методи обробки досліджуваного матеріалу з метою концентрації збудника - методи збагачення. 

Наводимо найбільш поширену та найменш трудомістку методику збагачення досліджуваного матеріалу. 

Кип'ятіння з содовим розчином 

Харкотиння хворого збирають у кишенькову плювальницю в кількості 10 - 20 мл. Туди додають рівний об'єм стерильного 5,0 % розчину харчової соди (бікарбонату натрію), ставлять на водяну баню і кип'ятять протягом 45 хвилин з моменту закипання води. Далі після охолодження вміст виливають в центрифужні пробірки, центрифугують при 3500 об/хв. протягом 25 - 30 хвилин, надосадову рідину зливають, а з осаду роблять тонкі мазки, фіксують їх, фарбують за Цілем-Нільсеном і мікроскопують під імерсійною системою світлового мікроскопу. 

Кип'ятіння з содовим розчином широко використовується в даний час, завдяки його простоті, ефективності, доступності та безпечності. 

Оцінка результатів світлової мікроскопії. 

Для запобігання отримання хибнопозитивних результатів при проведенні бактеріоскопії необхідно: 

ь імерсійне масло наносити на скельце піпеткою, не торкаючись поверхні мазка; 

ь об'єктив не повинен торкатися поверхні мазка, а легко стикатися з верхнім меніском імерсійного масла. 

Перегляд мазків треба робити за певною системою, це вимагає стандартизації, що гарантує перегляд найбільш репрезентативних полів у мазку. Для того, щоб переконатися в однократності проглядання полів зору, необхідно дотримуватися визначеного порядку і керуватися наступними рекомендаціями: 

ь перегляд мазків, забарвлених за Цілем-Нільсеном, завжди проводиться під 100 кратним об'єктивом з імерсією; 

ь обов'язково включати позитивний і негативний контролі. Позитивний контроль гарантує придатність розчинів до фарбування і правильність методу. Негативний контроль підтверджує відсутність у розчинах і барвниках кислотостійких артефактів; 

ь техніка перегляду мазка: мазок проглядається кілька разів по довжині зигзагоподібно; 

ь мазок можна кваліфікувати як негативний після перегляду не менше 300 полів зору. У досвідченого мікроскопіста на цю роботу піде 15 хвилин. У мазку площею 1,0 х 2,0 см кількість мікроскопічних полів зору від краю до краю буде відповідати 100. У випадку, якщо мазок явно позитивний, немає необхідності переглядати весь мазок і перегляд декількох полів (20-50) достатній для оцінки його як позитивного. 

Мікроскопічне дослідження повинне показати, чи присутні в мазку кислотостійкі палички, і, якщо присутні, необхідно дати їх кількісну оцінку в полі зору. При прямій бактеріоскопії у повноцінному полі зору повинен бути присутнім один з наступних елементів бронхіального секрету: лейкоцити, еластичні волокна і миготливий епітелій. Після збагачення цих елементів немає, бо вони зникають під впливом обробки матеріалу. Результати повинні бути представлені в кількісному вираженні. При фарбуванні мазків за методом Ціля-Нільсена рекомендується наступний порядок видачі результатів: 

Оцінка результатів бактеріоскопії при забарвленні за Цілем-Нільсеном

Примітки: 

КСП - кислостійкі палички; 

п/зору - поле зору. 

2.2.3 Люмінесцентна мікроскопія 

Люмінесцентна мікроскопія має більш високу чутливість у виявленні мікобактерій. Метод може бути використаний при різних видах обробки біологічного матеріалу. Цей метод значно збільшує діагностичну ефективність мікроскопічних досліджень. Швидкість виявлення мікобактерій, простота флюорохромування робить його широко доступним для практичних лабораторій. Перевагою методу люмінесцентної мікроскопії є те, що він дозволяє проводити дослідження при менших збільшеннях мікроскопа і, отже, переглядати в короткий термін значно більше полей зору, ніж при звичайній мікроскопії з імерсійною системою. Застосовуючи малі збільшення, вдається швидше виявити мікобактерії туберкульозу. Люмінесцентна мікроскопія дозволяє збільшити знахідки у порівнянні з прямою бактеріоскопією мазка. Цей метод крім того найбільш економічний з усіх бактеріоскопічних методів дослідження і рекомендується як основний метод в обласних протитуберкульозних диспансерах для проведення скринінгових досліджень із розрахунку 1 люмінесцентний мікроскоп на 500 тис. - 1 млн. населення. 

Даний метод мікроскопії грунтується на здатності мікобактерій сприймати люмінесцентні барвники і потім світитися при опроміненні ультрафіолетовими променями. При цьому в залежності від застосовуваних барвників мікобактерії дають яскраво-червоне світіння на зеленому, чи золотаво-жовте на темно-зеленому тлі поля зору. 

Існує ряд методик забарвлення препаратів для люмінесцентної мікроскопії: акридиновим жовтогарячим; аураміном і родаміном за Боєм; аураміном за Хагеманом; аураміном за Хагеманом в модифікації Набонна. 

Для забарвлення препаратів акридиновим жовтогарячим необхідні наступні реактиви: акрединовий жовтогарячий, 3,0 % солянокислий спирт, метиловий спирт, 10,0 % розчин аміаку. З акрединового жовтогарячого готується основний розчин шляхом розчинення 1,0 г барвника в 100,0 мл дистильованої води. З основного розчину готується робочий розчин шляхом додавання 10,0 мл основного розчину до 990,0 мл дистильованої води. Сюди ж додається 3 - 6 крапель 10,0 % розчину аміаку, рН має бути не менше 9,0. Мазки готують з осаду, отриманого при обробці матеріалу для посіву, краплю якого наносять на скельце звичайним способом. Препарати фіксуються метиловим спиртом протягом 3 - 5 хвилин. Скельця для препаратів повинні бути новими, тонкими і без подряпин. Забарвлення препаратів здійснюють шляхом занурення фіксованих мазків у робочий розчин акридинового жовтогарячого на 24 години без підігріву. Потім мазки двічі по 10 хвилин знебарвлюють 3,0 % солянокислим спиртом, промивають дистильованою водою, висушують у термостаті і мікроскопують. 

Для забарвлення препаратів аураміном і родаміном за Боєм необхідні наступні реактиви: аурамін 00, родамін С, 3,0 % солянокислий спирт, 0,25 % водний розчин метиленової синьки. Родамін С можна заміняти подвійною кількістю родаміу 6 Ж. Робочий розчин аураміну і родаміну готується шляхом додавання 1,0 г аураміну і 0,1 г родаміну до 1000,0 мл дистильованої води. Фіксований над полум'ям пальника мазок забарвлюють протягом 10 хвилин робочим розчином при легкому підігріванні, потім мазок промивають водою, знебарвлюють 3,0 % солянокислим спиртом і знову промивають водою. Гасіння тла роблять шляхом забарвлення препарату 0,25 % розчином метиленового синього, після чого препарат промивають водою, висушують на повітрі і мікроскопують. 

Методика забарвлення препарату за Хагеманом в модифікації Набонна (аураміновий метод): на фіксований мазок наливають розчин аураміну 00 на 15 хвилин (не нагрівають мазки й не використовують стрічки фільтровального папірця), потім препарат ретельно промивають водою, знебарвлюють солянокислим спиртом 3 - 5 хвилин, промивають водою, дофарбовують розчином кислого фуксину протягом 2 хвилин, ретельно промивають водою, висушують і мікроскопують. Забарвлені препарати мають малиново-червоний колір. При люмінесцентній мікроскопії клітини мікобактерій світяться золотаво-зеленим кольором на темному чи бурувато-червоному тлі. 

Методика забарвлення препаратів за Боєм в модифікації Полякової: фіксовані препарати забарвлюють розчином, що містить аурамін (1:1000) і родамін С (1:1000) протягом 20 хвилин. Потім препарат промивають водопровідною водою і знебарвлюють 3,0 % солянокислим спиртом протягом 3 - 5 хвилин. Потім цей препарат знову промивають водою і після гасіння тла 0,25 % розчином метиленової синьки протягом 1 - 2 хвилин, промивання водою і висушування, він готовий до мікроскопії. При даному методі забарвлення в препаратах при люмінесцентній мікроскопії клітини мікобактерій мають золотаво-жовтогарячий колір. 

При люмінесцентній мікроскопії необхідно правильно (відповідно до інструкцій) користуватися освітлювальною апаратурою. Позитивна відповідь дається при виявленні не менше 3-х клітин мікобактерій у препараті. Кількість клітин мікобактерій оцінюється так само, як і в методиці світлової мікроскопії препаратів, пофарбованих за Цілем-Нільсеном. 

Люмінесцентний метод мікроскопії підвищує результативність досліджень по виявленню клітин мікобактерій у досліджуваному матеріалі на 18,0 - 20,0 % у порівнянні зі світловою мікроскопією препаратів з нативного матеріалу і на 8,0 - 10,0 % - препаратів з матеріалу після збагачення. Слід зазначити, що люмінесцентна та пряма мікроскопія не дає можливості диференціювати M.tuberculosis від сапрофітних та умовно-патогенних мікобактерій. 

Приготування барвників і реактивів для люмінесцентної мікроскопії 

Розчин аураміну 00 і родаміну С (для забарвлення за Боєм): 

1,0 г аураміну і 0,1 г родаміну С розчиняють у 1000,0 мл дистильованої води (для цього розчину можна застосовувати родамін 6 Ж в кількості 0,2 г на 1000,0 мл дистильованої води). 

3,0 % солянокислий спирт (для забарвлення за Боєм): 3,0 мл соляної кислоти додається до 97,0 мл 70 % спирту. 

Розчин аураміну 00 (для забарвлення за Хагеманом): 1,0 г аураміну 00 розчиняють у 1000,0 мл дистильованої води. У фарбу додають 5,0 мл 5,0 % розчину карболової кислоти. Водний розчин аураміну 00 не повинен давати пластівців при додаванні в нього карболової кислоти.

Кислий фуксин (для забарвлення за Хагеманом): 1,0 г кислого фуксину розчиняється в 390,0 мл дистильованої води. До цього розчину додається 10,0 мл концентрованої оцтової кислоти. 

Солянокислий спирт (для знебарвлення препаратів при забарвленні за Хагеманом): до 90,0 мл спирту-ректифікату, налитого в градуйовану посудину, доливається 4,0 мл концентрованої соляної кислоти, що димить, і висипається 4,0 г хімічно чистої кухонної солі. Потім доливається дистильована вода до мітки 100,0 мл (частина нерозчиненої кухонної солі залишається в осаді). 

0,25 % розчин метиленової синьки: до 100,0 мл дистильованої води додається 0,25 г метиленового синього. Основні розчини флюорохромів можуть зберігатися в темряві багато місяців у темних флаконах, закритих скляними притертими корками чи гумовими корками, обгорненими алюмінієвою фольгою. Робочі розчини не повинні зберігатися більше 6 - 7 діб. Фільтрувальний папір застосовувати не можна. Якщо барвник розчинений не цілком і є осад, флакон з розчином на кілька годин можна помістити в термостат при 37 град. Цельсію. 

Оцінка результатів люмінесцентної мікроскопії. 

Мазки, пофарбовані для люмінесцентної мікроскопії, якщо неможливо переглянути відразу після приготування, слід зберігати в темному місці, переважно в холодильнику, максимум протягом доби, оскільки з часом інтенсивність світіння флюорохромів може знижуватися. 

При люмінесцентній мікроскопії мазків, як правило, використовується менше збільшення (250-630), у порівнянні зі збільшенням, використовуваним при перегляді мазків, пофарбованих за методом Ціля-Нільсена (1000). Поле зору в люмінесцентному мікроскопі охоплює більшу частину мазка, ніж при світловій мікроскопії. Представлена нижче схема дозволяє порівнювати результати, отримані в різних лабораторіях, незалежно від використаного методу мікроскопії і збільшення: 

Співвідношення результатів світлової та люмінесцентної мікроскопії

Примітка: 

КСП - кислотостійкі палички. 

Приклад: При перегляді мазка методом люмінесцентної мікроскопії виявлено 20 КСП у полі зору при збільшенні 450. Ділимо це число на коефіцієнт, приведений у схемі: 4, одержуємо порівнянний результат з результатом світлової мікроскопії - 5 КСП в полі зору, що може бути оцінене як 2 +, але не як 3 +. 

Після перегляду препаратів методом люмінесцентної мікроскопії при необхідності можна забарвити ці ж самі препарати за Цілем-Нільсеном та досліджувати їх в світловому мікроскопі. 

2.2.4 Фазовоконтрастна мікроскопія 

Фазовоконтрастна мікроскопія є єдиним мікроскопічним методом дослідження, що дозволяє спостерігати клітини мікобактерій і їх біологічно змінені форми в живому стані. Для її здійснення до звичайного світлового мікроскопу застосовується спеціальне фазовоконтрастне пристосування КФ-4. 

З методів фазовоконтрастної мікроскопії найбільше широко застосовується методика дослідження препаратів, приготовлених по типу препарату, що одержав назву "роздавлена крапля". Для готування даного препарату беруть чисте знежирене предметне скельце. На поверхню його бактеріологічною петлею чи піпеткою наносять краплю рідкої суспензії досліджуваних мікобактерій чи їх біологічно змінених форм, покривають краплю чистим і фламбірованим над полум'ям пальника покривним скельцем так, щоб між предметним і покривним скельцем не було пухирців повітря. Препарат поміщають на предметний столик мікроскопа і відповідно до правил здійснюють фазовоконтрастну мікроскопію. При цьому в полі зору мікроскопа стають помітними живі клітини мікобактерій чи їх біологічно змінені форми. Для фазовоконтрастної мікроскопії імерсійним методом на поверхню покривного скельця наносять краплю імерсійної олії, занурюють у неї імерсійний об'єктив і здійснюють мікроскопію. При цьому у полі зору спостерігають живі клітини мікобактерій і їх біологічно змінені форми, окремі деталі їх структури.

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10