МОРФОЛОГІЧНЕ ДОСЛІДЖЕННЯ – НАСКІЛЬКИ ВАЖЛИВІ
ЯКІСНІ ГІСТОЛОГІЧНІ ПРЕПАРАТИ?
ГОЛОВНІ ЧИННИКИ, ЯКІ ВИЗНАЧАЮТЬ ЯКІСТЬ ЗРАЗКІВ

І.В. Ліскіна, С.Д. Кузовкова, О.В. Лисенко, Л.М. Загаба

Усі люди в своєму житті так чи інакше, в більшій або меншій мірі стикаються з системою практичної охорони здоров’я. Патологоанатомічна служба є невід’ємною частиною цієї системи. Значення діяльності цієї служби важко переоцінити, оскільки основним завданням її залишається КОНТРОЛЬ за ефективністю лікувально-діагностичної роботи медичної установи. Це завдання вирішується за допомогою двох основних методів клініко-анатомічного аналізу:

-     прижиттєвої діагностики захворювань за результатами досліджень біопсійного та післяопераційного матеріалу;

-     спільної оцінки прозектором та клініцистом результатів розтину з метою більш глибокого розуміння патологоанатомічних механізмів несприятливого перебігу хвороби та її ускладнень, виявлення можливих діагностичних помилок та дефектів лікування померлого пацієнта, що має значення для підвищення кваліфікації лікарів та покращання організації лікувально-діагностичної роботи [1].

Тобто, одним із головних завдань роботи патологоанатомічного відділення або лабораторії є прижиттєве гістологічне дослідження біологічного матеріалу з метою уточнення клінічного діагнозу або ж взагалі – з’ясуванню патологічного процесу при не установленому клінічному діагнозі. Власне гістологічне дослідження – це мікроскопічне дослідження зразків (гістологічних зрізів) ураженої тканини людського організму, які представлені у гістологічному препараті.

Таким чином, однією із основних складових морфологічного дослідження є отримання правильно виготовленого якісного гістологічного препарату. Що це таке? У загальноприйнятому розумінні – це спеціальне скельце, на якому розміщується зріз тканини з отриманого при оперативному втручанні або при ендоскопічному дослідженні біологічного матеріалу. Останній може вкрай варіювати за розмірами – від ледве видимих оком шматочків величиною до 1 мм, до крупних зрізів тканини, площею до 4-5 см2 та більше. Тканина при рутинному (повсякденному) дослідженні забарвлюється барвниками – гематоксиліном і еозином, а потім зверху покривається ще покривним скельцем. Щоб останнє міцно покривало зріз тканини, у якості «клею» використовують спеціальні речовини, зокрема, канадський бальзам. Правильно виготовлений гістологічний препарат може зберігатися десятки років, без втрати якості власне тканинного зрізу, який розміщений під покривним скельцем.

Мало хто замислюється, наскільки складна та багатокрокова технологія отримання гістологічного препарату. Неправильне виконання (порушення) навіть одного з технологічних кроків легко приводить до отримання «дефектного» матеріалу, що унеможливлює подальше морфологічне дослідження лікарем-патологоанатомом, а, значить, і відсутність остаточного патологогістологічного висновку.

Можна умовно виділити наступні етапи отримання якісного гістологічного препарату:

– власне отримання біологічного матеріалу (біопсії, операційної резекції) хірургом під час виконання оперативного втручання або ендоскопічного дослідження з біопсією;

–      розміщення біологічного матеріалу у фіксуючий розчин;

–      проведення вирізки матеріалу для подальшого його дослідження;

–      проводка шматочків біологічного матеріалу у розчинах спиртів, підготовка до заливки його у парафінові блоки;

–      виготовлення парафінових блоків;

–      отримання гістологічних зрізів;

–      фарбування зрізів та завершення виготовлення гістологічного препарату.

Кожен з цих етапів має свої численні «підводні камені», які можуть звести увесь процес виготовлення гістологічного препарату нанівець.

Окреслимо головні особливості виконання кожного із зазначених етапів.

Для прикладу візьмемо до розгляду пацієнтів з бронхо-легеневою патологією, які звертаються до високоспеціалізованого закладу відповідного профілю, а саме – в Державну установу «Національний ННЦ фтизіатрії і пульмонології ім. Ф. Г. Яновського НАМНУ». У тих випадках, коли лікар-пульмонолог або фтизіатр не можуть чітко визначити конкретне захворювання лише на основі загальноприйнятих методів дослідження у практичній медицині – з’ясуванні наявних скарг, даних анамнезу недуги, результатів функціональних методів дослідження та радіологічних досліджень, лабораторних показників крові та сечі, зазвичай виникає необхідність у проведенні додаткових спеціальних процедур – мало-інвазивних методів дослідження з біопсією уражених тканин. У царині пульмонології та фтизіатрії наразі розроблено та застосовується досить широка палітра різних ендоскопічних досліджень. Під час виконання ендоскопічного дослідження (фібробронхоскопії, торакоскопії з біопсією плеври, тощо) лікар-ендоскопіст або лікар-хірург отримує біопсійний матеріал, скушуючи спеціальними щипцями фрагмент візуально найбільш зміненої тканини у ділянці дослідження. Наприклад, ділянку з горбистими змінами бронху, або ж виросту на бронху. Наразі існує ще методика – трансбронхіальна біопсія легеневої тканини, у випадках виявлення утворів у легеневій паренхімі на віддаленні від бронхів. Вона також виконується при ендоскопічному дослідженні за допомогою спеціальних голок. Можливе отримання матеріалу з уражених (змінених у розмірі, формі, щільності) внутрішньогрудних лімфатичних вузлів, зокрема методом EBUS TBNA.

При дослідженні плевральної порожнини (ендоскопічні методи торакоскопії, відеоторакоскопії) лікар-хірург також спочатку візуально оцінює стан тканини плеври та зовнішній вигляд легені, а потім здійснює біопсію найбільш змінених ділянок плеври і/або легені.

При вище згаданих дослідженнях зазвичай отримують незначну за об’ємом біопсію (шматочки тканини), яка зразу після отримання розміщується у фіксуючий розчин формаліну в спеціальних ємностях для біологічних рідин. Вже на цьому етапі можливі порушення, наприклад, якщо замість спеціального розчину залити біологічний матеріал водою, фізіологічним розчином або розчином спирту. При таких помилкових діях ще в операційній виникає порушення тканинної структури біопсійного матеріалу, причому при перебуванні матеріалу в «неправильному» розчині більше 1-2 годин матеріал стає повністю непридатним для подальшого гістологічного дослідження.

Значно більший за об’ємом біологічний матеріал отримують при діагностичних, лікувальних, діагностично-лікувальних операціях різного характеру. При оперативних втручаннях на легенях отримують для подальшого гістологічного дослідження від 1-2 сегментів легені до цілої легені у разі проведення пульмонектомії. При ексцизійній біопсії  лімфатичних вузлів отримують видалений вузол різних розмірів. При видаленні поверхневих (на шкірі або зразу під шкірою) утворів останні мають різні розміри. Після видалення біоматеріалу він якнайшвидше має бути поміщений у фіксуючий розчин. Це – так звана попередня фіксація, яка певною мірою ущільнює тканину, переважно її поверхневі ділянки.

Операційний матеріал в подальшому підлягає так званій гістологічній вирізці. Звичайно, після попередньої фіксації у розчині формаліну не менше 12 годин, у середньому 24-48 годин, лікар-патологоанатом і виконує вирізку. Сам процес вирізки – це отримання шматочків тканини з ураженням товщиною 4-5 мм та різної площі. Розмір площі шматочку найчастіше обумовлений вказаним лікуючим лікарем попереднім клінічним діагнозом. В середньому він складає 3,0-4,5 см2. У різних випадках отримують від 1-2 до 12-15 таких шматочків. Існує ціла низка інших вимог до отримання «правильних» вирізаних шматочків, які мають знати лікарі патологоанатоми або ж лаборанти-гістологи [1].

Загальні вимоги саме до таких розмірів шматочків при вирізці обумовлені, перш за все, подальшою процедурою їх гістологічної обробки: вони мають рівномірно та порівняно швидко просочуватися фіксуючим розчином, а у подальшому – розчинами спиртів, хлороформу, парафіном, тощо. Практичний досвід показав, що саме такі розміри шматочків якнайбільше відповідають зазначеним умовам [2].

Після вирізки кожний шматочок поміщають у гістокасету або ж у марлевий мішечок з обов’язковим маркуванням (ПІП хворого, дата отримання біоматеріалу) і максимально швидко знову занурюють у фіксуючий розчин для остаточного завершення фіксації.

Важливим моментом є дотримання послідовності первинного розміщення у ємності біоматеріалу і фіксатора: спочатку необхідно наливати фіксуючий розчин у ємність, а потім занурювати нативний біоматеріал. Якщо спершу в ємність помістити матеріал, особливо досить малих розмірів, то можливе прилипання матеріалу до стінок ємності з порушенням його тканинної будови.

Таким чином, для якісного проведення процедури фіксації необхідне дотримання наступних умов: 1) після вирізки шматочок його негайно поміщають у фіксуючий розчин; 2) об’єм фіксатора повинен перевищувати об’єм біоматеріалу в 10-20 разів (але не менше ніж у п’ять разів), тому що тканинна рідина може істотно змінити концентрацію фіксатора; 3) у випадку зміни кольору фіксуючого розчину після занурення матеріалу, його необхідно замінити іншим розчином; 4) неприпустиме повторне використання фіксуючого розчину [1,2,3].

Дофіксація вирізаних шматочків може тривати 12-24 години [3].

Декілька слів слід додати про фіксуючі засоби, які застосовуються у патологічній гістології. Їх існує багато, вони поділяються на прості та складні (фіксуючі суміші). Якісна фіксація з якнайменшою зміною прижиттєвої архітектоніки тканини – результат, який бажано досягти. Серед відомих наразі фіксаторів немає жодного ідеального, який би повністю відповідав цій вимозі. Але, як показав багаторічний досвід багатьох гістологічних закладів, у сфері патологічної гістології найчастіше застосовують формалін, який має хороші дифузійні властивості та незначний коагуляційний вплив на клітини тканини. Промисловий формалін зазвичай має незначні хімічні домішки, які слід нейтралізувати з метою покращання властивостей формаліну у якості фіксуючої рідини. Тому наразі з цією метою прийнято використовувати забуферений нейтральний формалін, 10 % розчин якого готують на фосфатному буфері з рН 7,0 [3, 5].

Термін фіксації має суттєвий вплив на якість гістопрепаратів. Так, зменшення терміну фіксації у розчині формаліну може бути недостатнім для фіксації тканини у зразках, що викликає дефекти зразка при подальшій обробці матеріалу («сирий» матеріал). Перевищення часу фіксації призводить до різного ступеня ретракції (значного ущільнення клітинних елементів тканини), в першу чергу, може викликати зміну ядерно-цитоплазматичного співвідношення, тобто деформацію клітин у тканині. Також відомо, що при фіксації матеріалу у формаліні більше 7 діб зморшкуватість ядер може змінитися їх набуханням [8].

Надалі виконують промивання гістокасет або мішечків з біоматеріалом у проточній воді приблизно тридцять хвилин [1,3,5] для звільнення тканини від надлишку фіксуючої рідини. Після промивання мішечки з тканиною злегка просушують фільтрувальним папером.

Після цього матеріал підлягає процедурі проводки, а саме, поступовій дегідратації (зневодненню) у “батареї” розчинів етилового спирту зростаючої концентрації: 50°С, 60°С, 70°С, 80°С, 90°С, 96°С(I), 96°С(II) та 100°С, за можливості. При перенесенні зразка з однієї ємності до наступної зразок у марлевому мішечку бажано просушувати фільтрувальним папером. Це робиться перед кожним перенесенням з метою збереження якості спиртових розчинів та більш тривалого терміну їх використання. Мета усієї процедури дегідратації – отримання максимального зневоднення зразків тканини. Від повноти зневоднення зразка залежить якість наступної процедури – заливки зразків у парафін [1].

Важлива умова – тривалість перебування біоматеріалу в окремих спиртових розчинах. Вона визначається розміром та властивостями конкретних зразків тканини [1,3]. Зазвичай зразки середніх розмірів (товщиною ~ 5 мм) достатньо тримати у кожному спирті 2-4 години. Загалом процедура проводки операційного матеріалу триває 3-4 дні. За необхідності більш тривалого перебування зразків тканини у спиртових розчинах (у зв’язку з технічними причинами), можливо залишати шматочки в «індиферентних» спиртах 70-80 % концентрації [3,5].

Після максимального зневоднення у спиртах [1,3,5] біоматеріал поміщають у ємності з хімічно чистим хлороформом (мінімально використовують дві ємності). Хлороформ – це речовина, яка має властивість витісняти спирт із шматочків тканини та водночас є розчинником парафіну. Спочатку шматочки тримаються біля поверхні рідини, а з просоченням тканини хлороформом вони поступово занурюються у рідину та падають на дно ємності. Одна з умов якості проведення даної процедури – особливість зберігання розчинів хлороформу. Хлороформ слід зберігати у темних ємностях, оскільки на світлі він легко розкладається.

Наступний крок: згідно до принципу поступового заміщення розчинів, зразки поміщають у так звану «кашу», яка складається з хлороформу та парафіну у співвідношенні 1:1. Каша має перебувати у термостаті при 37°С для зберігання її рідкого стану [3]. Тривалість перебування шматочків тканини у каші складає 3–6 годин. Надмірна тривалість перебування зразків у суміші хлороформ-парафін погіршує якість різки тканини. Надалі зразки поміщають у дві послідовні ємності з рідким парафіном, де вони перебувають терміном 1-1,5 години в кожній в термостаті при температурі 58°С [1,2,3].

Загальний термін процедури загальної проводки дрібного біопсійного матеріалу може скорочуватися за рахунок витримки зразків у спиртових розчинах по 1 годині [1,2,3,4].

Таким чином, зразки підготовлені до наступного етапу – процедури заливки у парафінові блоки. Наразі для цього широко застосовують спеціальне обладнання – гістоцентри для заливки зразків тканини у парафін.

Лаборант-гістолог швидко послідовно розкладає шматочки зразків теплим пінцетом у спеціальні форми для заливки та за допомогою регулятора автоматичної подачі парафіну відповідної температури заливає зразок [5]. Зразу ж цю форму з шматочком тканини переміщають на охолоджувальний столик, де на ще розплавлений парафін зверху накладають гістокасету з маркуванням зразка та щільно притискають, витримують декілька секунд для її прилипання. Касета із залитим парафіном зразком негайно поміщається на охолоджувальну платформу. Охолодження звичайно триває 15-25 хвилин, після чого заливочна форма досить легко відокремлюється від гістокасети зі зразком. Гістокасета, таким чином, вже містить парафіновий блок із залитим у нього шматочком тканини. При кімнатній температурі він має остаточно «вистояти» ще декілька годин для досягнення рівномірної температури та консистенції по усій товщі блоку.

Готовий парафіновий блок має відповідати наступним критеріям якості:

-   мати однорідну гладеньку поверхню (без щербин, повітряних пухирців, тріщин, ущільнень);

-   шматочок тканини має бути розміщений максимально близько до поверхні блоку та посередині його площі;

-   в основі парафінового блоку має буди достатня кількість парафіну, це необхідно для утримання блоку від його відокремлення від гістокасети під час зрізування ножем на мікротомі [6].

Слід зауважити, що правильно виготовлені парафінові блоки з біоматеріалом можуть зберігатися роками, без втрати якісних характеристик шматочку тканини, яка в них знаходиться. Головна умова зберігання – сухе приміщення з діапазоном температури орієнтовно від 10 до 28 °С.

Парафінові блоки готові до наступного етапу – виготовлення зрізів з парафінових блоків на мікротомі. В патоморфологічних лабораторіях використовують різні моделі мікротомів – санний, ротаційний, кріостат, мікротоми з електронним управлінням та моторним приводом, з електронною системою подачі зрізів та механічним приводом [1].

Наразі, за нашим власним досвідом, найбільш привабливими є точні ротаційні мікротоми. Конструкція таких мікротомів забезпечує можливість виготовляти якісні серійні (товщиною 4-7 мкм) зрізи, практично однакової товщини по усій площі. Власне різка блоку з біоматеріалом має деякі особливості, але вона досить проста, якщо не було «огріхів» на попередніх етапах обробки матеріалу. Існують певні критерії якісних зрізів, зокрема, вони мають формувати «стрічку» із цілісних серійних зрізів, в яких добре видно шматочок тканини.

Готові зрізи переносять у ємність з теплою дистильованою водою (35-40°С) для максимального розправлення зрізу тканини, а після цього переносять на предметне скельце (попередньо промарковане). Скельце зі зрізом підсушують на спеціальному нагрівальному столику з температурою 51-52°С [1,3,5].

Препарат підготовлений до завершальної процедури – забарвлення тканини. Вона включає наступні кроки: підготовчий етап, безпосереднє забарвлення. препаратів, покриття забарвленого зрізу бальзамом і покривним скельцем [1,5].

Підготовчий етап складається з двох процедур: депарафінування та регідратації тканини зрізу. Перед депарафінуванням препарати (скельця зі зрізами) поміщають у термостат з температурою 37°С приблизно на 20-30 хвилин. Саму депарафінізацію проводять у двох послідовних ємностях з розчинником (ксилол або толуол), у кожній по 3-5-хвилин. Препарати підсушують фільтрувальним папером, далі вони підлягають регідратації у декількох ємностях з низхідними концентраціями спиртів протягом 2-4 хвилин у кожній та наступним переносом у ємність з дистильованою водою на 2-5 хвилин [2].

Розчини ксилолу та спирту необхідно міняти на «чисті» після обробки в них орієнтовно 150 та 50 препаратів (скелець зі зрізами) відповідно [1,5].

Дуже відповідальним є етап забарвлення гістологічних зрізів. Від правильного виконання даного етапу значною мірою залежить адекватність морфологічної картини, а відповідно, й результат гістологічного висновку. Труднощі на цьому етапі можуть бути пов’язані з перефарбуванням або ж з недофарбуванням зрізів тканини. Ці недоліки можуть бути обумовлені зміною кімнатної температури у лабораторії, необхідністю заміни фарбувальних рідин, неточним вибором тривалості фарбування, видом тканини, тощо. Так наприклад, при фарбуванні лімфатичних вузлів гематоксиліном та еозином, тривалість забарвлення гематоксиліном складає до 0,5 хвилин, тоді як для інших тканин середній термін фарбування складає декілька хвилин. Багато з термінів різних процедур підбирається дослідним шляхом, вони можуть з часом мінятися.

Перед забарвленням слід перевіряти якість розчину барвника. Іноді він може потребувати фільтрування (або заміни). Найбільш розповсюдженою, рутинною методикою забарвлення різних тканин, яка доволі вдало поєднує контрастне забарвлення як ядер, так і цитоплазми клітин, є гематоксилін та еозин. Слід зазначити, що зараз налагоджено промислове виробництво готових розчинів цих барвників належної якості. Вибір інших, як правило, додаткового барвника (барвників), обумовлюється попереднім мікроскопічним дослідженням гістопрепарата, забарвленого гематоксиліном і еозином, з метою більш точного патологогістологічного висновку у кожному конкретному клінічному випадку. Фарбування проводиться послідовно у низці ємностей з барвниками та розчинами для промивки скелець зі зрізами (дистильована або проточна вода) згідно протоколу [7]. При завершенні фарбування тканини зріз знову піддають дегідратації у 2-3 розчинах спиртів зростаючої концентрації, поміщають у ксилол (толуол), що є підготовкою для нанесення фіксуючого бальзаму.

Останній етап виготовлення гістопрепарата – нанесення гістологічного бальзаму на зріз тканини та зверху – покривного скельця. Гістологічні бальзами мають консервуючі властивості. Після цього бажано поміщати препарати під наважку (вона поміщається прямо на покривне скельце) на півгодини або більше з метою видалення можливих мікропухирців повітря з бальзаму.

Препарат готовий до мікроскопічного дослідження, тобто для гістологічної діагностики процесу, який може бути саме в представленому зрізі тканини.

Додатково ще слід відмітити, що на виготовлення якісного гістологічного препарату також впливають наступні чинники:

-       термін придатності реактивів та розчинів, що використовуються;

-       умови зберігання реактивів та розчинів;

-       точне дотримання нормативної тривалості кожної з послідовних процедур;

-       хімічна чистота або «забрудненість» робочих реактивів;

-       температурні умови лабораторного приміщення;

-       професійність і досвід лаборанта-гістолога.

Таким чином, лише на одному з розділів роботи патоморфологічної лабораторної служби, а саме, процедурі виготовлення гістологічних препаратів, нами продемонстровано досить складний процес отримання якісних гістологічних препаратів.

Правильно виготовлені гістологічні препарати – це основа для адекватного відображення морфологічної картини зразку, а значить, і забезпечення її правильної інтерпретації при наступному дослідженні патологічних змін тканини лікарем-патологоанатомом. Помилки та неправильне проведення різних етапів у виготовленні гістологічних препаратів можуть приводити до численних артефактів у зрізі тканині, що, відповідно, унеможливлює постановку патологоанатомічного діагнозу.

Результат мікроскопічного дослідження, яке проводить лікар-патологоантом, оформлюється як гістологічний висновок [9].

Список літератури

1.  Благодаров В.М., Вербицький В.В., Гавриш О.С., Конончук М.А., Діброва В.А. Патологія: клініко-анатомічний аналіз. Навчальний посібник для студентів вищих медичних закладів. Київ. СМП «АВЕРС», 2001. 136 с.

2.  Волкова О.В., Елецкий Ю.К. Основы гистологии с гистологической техникой. М.: «Медицина», 1971. 272 с.

3.  Дегтярьова Л.В., Гребеньщикова Н.О. Артефакти при гістологічних і гістохімічних дослідженнях: причини виникнення, шляхи запобігання // Патологія. 2009. № 1. С. 100–104.

4.  Коржевский Д.Э., Гиляров А.В. Основы гистологической техники. СПб.: СпецЛит, 2010. 95 с.

5.  Методики морфологічних досліджень: монографія / М.М. Багрій та ін. ; за ред.. М.М.Багрія, В.А.Діброви. Вінниця: Нова Книга, 2016. 328с.

6.  Пальцев М.А., Франк Г.А., Мальков П.Г. Стандартные технологические процедуры при морфологическом исследовании биопсийного и операционного материала // Архив патологии. 2011. № 3 (приложение). 113 с.

7.  Саркисов Д.С., Перов Ю.Л. Микроскопическая техника (руководство для врачей и лаборантов). М.: Медицина, 1996. 543 с.

8.  Ташкэ К. Введение в количественную цито-гистологическую морфологию. Изд-во Бухарест, 1980. 191 с.

9.  Bancroft J.D., Gamble M. Theory and practice of histological techniques. Edinbugh-London-N.Y: Сhurchill Livingstone, 2002. 796 р.